Aplicación de la tecnología de cromatografía en la química medicinal tradicional china
1. El principio básico de la cromatografía: El proceso de cromatografía se basa en la diferencia en el coeficiente de partición entre dos disolventes de "fase" mutuamente inmiscibles (cromatografía de distribución) y la diferencia en la capacidad de adsorción de los componentes para el adsorbente (cromatografía de adsorción), y el intercambio de moléculas y su tamaño (cromatografía de exclusión). Por lo general, la fase móvil general se llama cromatografía de gases y la fase móvil se llama cromatografía líquida.
1. Cromatografía de adsorción (cromatografía de adsorción)
(1) La relación entre el adsorbente, el disolvente y las propiedades de la sustancia separada: la cromatografía de adsorción líquido-sólido es un método ampliamente utilizado. Este método es particularmente adecuado para la separación de muchas muestras de peso molecular medio (muestras de baja volatilidad con un peso molecular inferior a 1.000). En particular, el componente liposoluble I generalmente no es adecuado para la separación de muestras de alto peso molecular como tales. como proteínas, polisacáridos o compuestos iónicos hidrófilos. El efecto de separación de la cromatografía de adsorción depende de las propiedades del adsorbente, el disolvente y los compuestos a separar.
1. Adsorbentes: Los adsorbentes más utilizados incluyen gel de sílice, alúmina, carbón activado, silicato de magnesio, poliamida, tierra de diatomeas, etc.
(1) Gel de sílice: El gel de sílice para cromatografía es un material poroso con una estructura reticulada de siloxano en las moléculas y en las partículas.
Hay muchos grupos silanol en la superficie de las partículas. La adsorción del gel de sílice está relacionada con el contenido de grupos silanol. Los grupos silanol pueden adsorber agua formando enlaces de hidrógeno, por lo que la fuerza de adsorción del gel de sílice disminuye a medida que aumenta el agua adsorbida. Si la tasa de absorción de agua supera el 17%, la fuerza de adsorción es demasiado débil y no puede usarse como adsorbente, pero puede usarse como apuntalante para la cromatografía de partición. Para la activación del gel de sílice, cuando el gel de sílice se calienta a 100 ~ 110 °C, se puede eliminar el agua adsorbida por los enlaces de hidrógeno en la superficie del gel de sílice. Cuando la temperatura aumenta a 500 °C, los grupos silanol en la superficie del gel de sílice también pueden deshidratarse y convertirse en enlaces siloxano, perdiendo así la actividad de absorción de agua debido a los enlaces de hidrógeno y ya no tienen las propiedades de un adsorbente. Incluso después del tratamiento del agua, su actividad de adsorción se reducirá y no podrá restaurarse. Por lo tanto, la activación del gel de sílice no debe realizarse a temperaturas más altas (generalmente se pierde una pequeña cantidad de agua unida por encima de 170 cC).
El gel de sílice es un adsorbente ácido, adecuado para cromatografía de componentes neutros o ácidos. Al mismo tiempo, el gel de sílice es un intercambiador de cationes débilmente ácido y los grupos silanol de su superficie pueden liberar iones de hidrógeno débilmente ácidos. Cuando se encuentran sustancias inyectadas con álcalis fuertes, los compuestos alcalinos pueden adsorberse debido a reacciones de intercambio iónico.
(2) Óxido de aluminio: el óxido de aluminio puede ser alcalino (porque se puede mezclar con ingredientes como el carbonato de sodio), lo que es ideal para separar algunos ingredientes herbales chinos alcalinos, como los alcaloides. Sin embargo, la alúmina básica no es adecuada para la separación de aldehídos, cetonas, vinagres, lactonas y otro tipo de compuestos. Porque en ocasiones la alúmina alcalina puede sufrir reacciones secundarias con los componentes anteriores, como isomerización, oxidación, eliminación, etc. Las impurezas alcalinas de la alúmina se pueden eliminar lavando con agua hasta alcanzar la neutralidad, lo que se denomina alúmina neutra. La alúmina neutra todavía pertenece a la categoría de adsorbentes alcalinos y debería ser adecuada para la separación de componentes ácidos. El tratamiento de la alúmina con ácido nítrico diluido o ácido clorhídrico diluido no solo puede neutralizar las impurezas alcalinas contenidas en la alúmina, sino que también hace que la superficie de las partículas de alúmina transporte aniones NO3-1 o CI-1, por lo que tiene la propiedad de separarse de el intercambiador. , adecuado para la separación cromatográfica de componentes ácidos. Este tipo de alúmina se llama alúmina ácida. La alúmina para cromatografía se utiliza para la cromatografía en columna, con un tamaño de partícula de 100 ~ 160 malla. El tamaño de partícula es de malla 100 y el efecto de separación es deficiente: menos de malla 160, el caudal de concentración es grande y lento y es fácil de dispersar. La relación entre la muestra y la alúmina generalmente está entre 1: 20 ~ 50, y la relación entre el diámetro interno de la columna cromatográfica y la longitud de la columna está entre 1: 10-20.
Al lavar la columna con disolvente, el caudal no debe ser demasiado rápido. Normalmente, el caudal del eluyente debe ser igual a los mililitros de líquido que salen cada media hora a 1 hora y al peso (gramos) del adsorbente utilizado.
(3) Carbón activado: Es un adsorbente apolar y de uso muy extendido. Generalmente, es necesario lavar primero con ácido clorhídrico diluido, luego lavar con etanol, luego lavar con agua y luego secar a 80 °C para análisis cromatográfico. El carbón activado utilizado para la cromatografía debe estar lleno de gránulos.
Si se trata de un polvo fino de carbón activado, agregue una cantidad adecuada de tierra de diatomeas como ayuda de filtración e instálela en la columna para evitar un caudal demasiado lento. El carbón activado se utiliza principalmente para separar componentes solubles en agua como aminoácidos, azúcares y algunos glucósidos. El carbón activado tiene un buen efecto de adsorción, pero su efecto de adsorción es débil en soluciones acuosas y disolventes orgánicos. Por lo tanto, el agua tiene la capacidad de elución más débil, mientras que los disolventes orgánicos tienen la capacidad de elución más fuerte. Por ejemplo, cuando se eluye con etanol-agua, la fuerza de elución aumenta al aumentar la concentración de etanol. El carbón activado adsorbe compuestos aromáticos más que compuestos alifáticos y adsorbe compuestos macromoleculares más que compuestos de moléculas pequeñas. Estas diferencias de adsorción se pueden utilizar para separar sustancias aromáticas solubles en agua de sustancias alifáticas, monosacáridos de polisacáridos y aminoácidos de polipéptidos.
2. Disolvente: La elección del disolvente durante el proceso de cromatografía tiene un gran impacto en la separación de componentes. El disolvente (agente único o disolvente mixto) utilizado en la cromatografía en columna se denomina habitualmente eluyente y, cuando se utiliza en cromatografía en capa fina o en papel, a menudo se denomina agente revelador. La elección del eluyente debe considerarse en función de la combinación de sustancias que se separan y las propiedades del adsorbente elegido. Cuando la sustancia separada es una sustancia débilmente polar, normalmente se selecciona como eluyente un disolvente débilmente polar. Si la sustancia separada es un componente altamente polar, se debe seleccionar un disolvente polar como eluyente. Si se utiliza un adsorbente débilmente adsorbente para sustancias polares (como tierra de diatomeas o talco en lugar de gel de sílice), también se debe reducir correspondientemente la polaridad del eluyente.
En la operación de capa de columna, la muestra separada se puede agregar mediante este método, o se puede seleccionar un solvente adecuado para disolver la muestra y luego agregar. El disolvente utilizado para disolver la muestra debe ser de baja polaridad para que los componentes separados puedan adsorberse. Luego aumente gradualmente la polaridad del disolvente. Este aumento de polaridad es un proceso muy lento llamado "elución en gradiente", mediante el cual los componentes adsorbidos en la columna se eluyen uno por uno. Si la polaridad aumenta demasiado (el gradiente es demasiado grande), no se puede obtener una separación satisfactoria. La capacidad de elución de un disolvente a veces puede expresarse mediante la constante dieléctrica (ε) del disolvente. Cuanto mayor sea la constante dieléctrica, mayor será la capacidad de elución. La secuencia de elución anterior sólo se aplica a adsorbentes polares como gel de sílice y alúmina. Para los adsorbentes no polares, como el carbón activado, el orden es exactamente el contrario, siendo la adsorción formada en agua o disolventes hidrófilos más fuerte que en los disolventes liposolubles.
3. Naturaleza de la sustancia separada: La sustancia separada, el adsorbente y el eluyente constituyen los tres elementos en la cromatografía de adsorción, y están estrechamente relacionados. Bajo condiciones específicas de adsorbente y eluyente, la separación de cada componente está directamente relacionada con la estructura y propiedades de las sustancias separadas. En el caso de los adsorbentes polares, los componentes son altamente polares y tienen fuertes propiedades de adsorción.
Por supuesto, la visión molecular general de los ingredientes de las hierbas medicinales chinas es importante. Por ejemplo, cuantos más grupos polares, mayor será la energía de adsorción y cuantos menos átomos de carbono haya en el homólogo, más fuerte será la adsorción. En resumen, mientras existan diferencias estructurales entre los dos componentes, la separación es posible y la clave está en la elección de las condiciones. Debe considerarse en función de la relación entre la naturaleza de la sustancia a separar, la fuerza de adsorción del adsorbente y la naturaleza del disolvente. Primero considere la polaridad de la sustancia que se está separando. Si la sustancia a separar tiene muy poca polaridad, es un terpeno sin oxígeno o contiene oxígeno pero grupos no polares, es necesario elegir un adsorbente con fuerte capacidad de adsorción y eluir con un disolvente débilmente polar como éter de petróleo o benceno. . La mayoría de los ingredientes de la medicina tradicional china son muy polares, por lo que es necesario elegir un adsorbente con un rendimiento de adsorción débil (generalmente de grado III a IV). La polaridad del eluyente utilizado debe determinarse de acuerdo con un cierto gradiente de pequeño a grande, o se debe utilizar cromatografía en capa fina para determinar la separación de la sustancia separada en el sistema disolvente. Además, la posibilidad de obtener una separación satisfactoria también está estrechamente relacionada con la elección del gradiente de disolvente. Se proporciona un ejemplo para ilustrar la relación entre el adsorbente, el eluyente y la polaridad de la muestra en la cromatografía de adsorción. En el caso de mezclas de varios componentes, como por ejemplo aceites y grasas vegetales, se compone de alcanos, alquenos, ésteres de alcohol, triacetina y ácidos grasos. Cuando se utiliza gel de sílice como adsorbente, se selecciona una serie de disolventes mixtos para eluir el aceite adsorbido. Cada componente del aceite se puede eluir en secuencia según su polaridad.
Para otro ejemplo, las saponinas esteroides C-27 se pueden separar según el número de grupos hidroxilo en las palabras: disolver las saponinas mixtas en benceno que contenga 5% de cloroformo, agregar una columna de adsorción de alúmina y eluir con el siguiente gradiente de disolvente. Si se usa silicato de magnesio con adsorción débil en lugar de alúmina, la polaridad del eluyente debe reducirse en consecuencia debido a la adsorción débil del silicato de magnesio. Es decir, se puede usar benceno o benceno que contenga 5% de cloroformo para eluir el grupo monohidroxilo del. adsorbente. saponinas. Este ejemplo ilustra que cuando los mismos componentes de la medicina herbaria china se separan cromatográficamente en diferentes adsorbentes, se requieren diferentes disolventes para lograr el mismo efecto de separación, ilustrando así la relación entre el adsorbente, el disolvente y los componentes que se van a separar.
(2) Cromatografía en capa fina: La cromatografía en capa fina es un método de cromatografía de microvolúmenes sencillo, rápido y. Generalmente, el adsorbente de la cromatografía en columna se extiende sobre una superficie plana, como un portaobjetos de vidrio, para formar una capa delgada, lo que se denomina cromatografía en capa fina. Su principio es básicamente similar al de la cromatografía en columna.
1. Características de la cromatografía en capa fina: Comparación de la aplicación y funcionamiento de la cromatografía en capa fina y la cromatografía en columna.
2. Selección de adsorbentes: Los principios para seleccionar adsorbentes para cromatografía en capa fina son los mismos que para la cromatografía en columna. La principal diferencia es que la TLC requiere que el tamaño de partícula del adsorbente (apuntalante) sea más fino, generalmente menos de 250 mallas, y el tamaño de partícula debe ser uniforme. Generalmente, la actividad del adsorbente o de la capa fina prefabricada utilizada en la cromatografía de capa fina no debe ser demasiado alta, y los niveles II a III son apropiados. La distancia de difusión depende del tamaño de partícula de la capa delgada. Cuanto más fino sea el tamaño de partícula de la capa delgada, más corta será la distancia de expansión, generalmente menos de 10 cm; de lo contrario, puede causar difusión cromatográfica y afectar el efecto de separación.
3. Selección del agente revelador: TLC, cuando la actividad del adsorbente alcanza un cierto valor (como nivel II o nivel III), la separación satisfactoria de muestras multicomponente depende de la selección del revelador. agente. Entre los componentes liposolubles, los componentes químicos de las hierbas medicinales chinas se pueden dividir en no polares, débilmente polares, de polaridad media y de polaridad fuerte según su polaridad. Sin embargo, en el trabajo real, a menudo es necesario utilizar la polaridad del disolvente para ajustar la polaridad del revelador. 4. Capas finas especiales: Para la separación y detección de algunos compuestos con propiedades especiales, a veces se necesitan algunas capas finas especiales.
① Capa fina fluorescente: Cuando algunos compuestos son incoloros y no muestran fluorescencia bajo la luz ultravioleta, y no existe un revelador de color adecuado, se pueden añadir sustancias fluorescentes al adsorbente para formar una capa fina fluorescente, por ejemplo análisis cromatográfico. Después de desplegarse, se irradia con luz ultravioleta. La placa de capa fina tiene fluorescencia, pero las manchas de la muestra no tienen fluorescencia y se puede detectar la posición cromatográfica de la muestra. Las sustancias fluorescentes más utilizadas son sustancias inorgánicas. Uno es el silicato de zinc, que muestra fluorescencia bajo la excitación de luz ultravioleta de 254 nm, como la limpieza activada por manganeso. El otro son los picos de sulfuro de zinc, que emiten fluorescencia bajo la excitación de luz ultravioleta de 365 nm, como la activación de plata.
②Capa fina compleja: La capa fina de nitrato de plata se suele utilizar para separar una serie de compuestos con el mismo número de átomos de carbono pero diferente número de dobles enlaces carbono-carbono, como alcoholes insaturados, ácidos, etc. El mecanismo principal es que el enlace carbono-carbono puede formar un complejo con nitrato de plata, mientras que el enlace carbono-carbono saturado no forma complejo con nitrato de plata. Por lo tanto, sobre una fina capa de nitrato de plata, los productos químicos pueden separarse debido a diferencias de saturación. En cromatografía, los compuestos saturados muestran Rf debido a la adsorción más débil. El valor de Rf de un doble enlace es mayor que el de dos dobles enlaces, y el valor de Rf de un triple enlace es mayor que el de un doble enlace. Además, en la plataforma de doble enlace, la complejación cis con nitrato de plata es más fácil que la complejación trans. Por tanto, también se puede utilizar para separar isómeros cis-trans.
③Capa fina ácido-base y capa fina de tampón de PH: para cambiar la acidez y alcalinidad originales del adsorbente, se puede utilizar ácido diluido o álcali diluido en lugar de agua para preparar una capa fina. Por ejemplo, el gel de sílice es ligeramente ácido y a veces no puede separar bien sustancias alcalinas como los alcaloides. Si no se puede esparcir o colar, puede usar una solución alcalina diluida de 0,1 ~ 0,5 nna0h para hacer una capa fina de gel de sílice alcalino al extender la capa fina. Por ejemplo, cuando se usa gel de sílice como adsorbente y se usa cloroformo-acetona-metanol (8:2:1) como agente revelador, el RF es inferior a 0,1 cuando se usa el mismo agente revelador como gel de sílice alcalino. capa fina, el valor Rf aumenta hasta aproximadamente 0,4. Explique que la fisostigmina es un alcaloide alcalino. 5. Aplicación: La cromatografía de capa fina se utiliza principalmente para el estudio de componentes químicos de la medicina herbaria china, como pruebas preliminares e identificación de componentes químicos, exploración de las condiciones de separación de columnas, etc.
El examen preliminar de los componentes químicos de los materiales medicinales chinos mediante cromatografía en capa fina se puede realizar en función de las propiedades de diversos componentes y condiciones bien conocidas. Dado que algunas impurezas se pueden separar después de esparcirlas en una capa delgada, la selectividad es alta y los resultados de las pruebas previas son más confiables.
Identificación de componentes químicos y muestras estándar de plantas medicinales chinas mediante cromatografía en capa fina. Si después de revelar con varios disolventes, el valor Rf, la forma de la mancha y el color de la sustancia estándar y de la sustancia probada son exactamente iguales, se puede concluir que son el mismo compuesto. Sin embargo, generalmente es necesario comprobarlo mediante reacciones químicas o métodos de análisis instrumentales como la espectroscopia infrarroja.
Explorar las condiciones de separación en columna mediante cromatografía en capa fina es un método rutinario en el laboratorio. Al realizar la separación en columna, primero debe elegir qué tipo de adsorbente y eluyente. Durante el proceso de elución, se puede utilizar la separación en capa fina para determinar y examinar el orden en el que se eluirá cada componente y si cada eluyente es un componente único o una mezcla. La separación previa en capa fina también permite comprender la composición y el contenido relativo de muestras de varios componentes. Si se encuentran condiciones de separación satisfactorias en capas delgadas, se pueden utilizar en cromatografía en columna seca. Sin embargo, las condiciones de separación de la capa fina también se pueden cambiar apropiadamente y transferir a la separación en columna preparativa por elución utilizada habitualmente para la siguiente capa.
Cuando se utiliza la separación previa en capa delgada para encontrar las condiciones de elución de la columna, se supone que el valor Rf medido en la capa delgada es la movilidad específica (R) de la muestra en la capa de la columna. Esto se debe a que cuando la capa delgada se despliega, el solvente contenido en la fase estacionaria de la capa delgada continúa evaporándose, lo que hace que la cantidad de solvente contenida en cada punto de la capa delgada sea desigual y el contenido cerca de la línea inicial sea mayor que eso. en el frente de la capa delgada. Sin embargo, si las condiciones de operación cromatográfica se controlan estrictamente, se puede obtener un valor de Rf cercano al valor real. Cuando los componentes están separados por capas delgadas, sus valores de Rf generalmente oscilan entre 0,85 > RF > 0,05. Además, la cromatografía de capa fina también se utiliza en la inspección de autenticidad, control de calidad e investigación de recursos de variedades de hierbas medicinales chinas, materiales medicinales y sus preparaciones. Es un medio eficaz para controlar procesos de reacciones químicas, detectar subproductos de reacciones, analizar intermediarios, detectar impurezas en productos químicos y preparaciones, pruebas clínicas y bioquímicas y analizar venenos.