Combinación de cortes en parafina y técnicas inmunológicas

La combinación de tecnología de seccionamiento de tejidos y tecnología inmunológica constituye la tecnología de inmunocitoquímica. Sobre la base del principio de unión específica de antígenos y anticuerpos, se realizan observaciones e investigaciones cualitativas y localizadas sobre la detección de macromoléculas como polipéptidos y proteínas en cortes de tejido. Independientemente de la técnica de inmunohistoquímica utilizada, incluye la preparación de anticuerpos, el procesamiento de material tisular, la preparación de portaobjetos y la inmunotinción. El procedimiento de sección congelada es simple y la actividad del antígeno se pierde menos durante el proceso de preparación, pero la morfología de las células del tejido es deficiente. El corte con parafina tiene muchos pasos y reduce la actividad del antígeno, pero la morfología de las células del tejido es clara. Es uno de los métodos convencionales para preparar secciones para inmunohistoquímica. Generalmente, se utilizan secciones de tejido incluidas en parafina para detectar antígenos en el citoplasma o el núcleo, y la tinción de antígenos de superficie no es adecuada. Algunas personas sumergen tejidos frescos en tampón de fosfato frío durante 48 horas y luego los fijan con etanol al 96% u otros fijadores, que pueden usarse para teñir antígenos de superficie. Los fijadores como el etanol y la acetona causan menos daño a los antígenos, pero tienen una preservación estructural peor. Los fijadores más utilizados son la formalina neutra y tamponada, que se une de forma cruzada a proteínas para bloquear los antígenos. Antes de la inmunotinción, las secciones se digirieron con proteasa para exponer los sitios antigénicos y mejorar las respuestas antigénicas. Las tinciones inmunohistoquímicas de uso común en secciones de parafina incluyen el método PAP (método de peroxidasa-antiperoxidasa sin marcar) en la tecnología de histoquímica inmunoenzimática y el método ABC (tinción bioquímica con avidina) en la tecnología de inmunohistoquímica de afinidad, con fuerte especificidad y alta sensibilidad. . Las secciones de tejido que utilizan ambos métodos de tinción deben incubarse con el primer anticuerpo (varios antisueros); incubarse con el segundo anticuerpo o el segundo anticuerpo marcado con biotina, incubarse con el complejo PAP o el complejo ABC y, finalmente, usar la solución DAB (diaminobencidina) -H2O2; desarrolla color, formando un precipitado marrón-amarillo. La tinción doble de rutina, la deshidratación, la transparencia y el sellado en muestras de portaobjetos permanentes pueden detectar componentes que son difíciles de visualizar con métodos de tinción convencionales o especiales y su posicionamiento preciso bajo un microscopio óptico, y pueden usarse para investigación básica, investigación de patología clínica y diagnóstico. La aplicación de microondas en la tinción inmunohistoquímica de secciones incluidas en parafina no solo simplifica los pasos y ahorra tiempo, sino que también mejora el efecto de la inmunotinción.

El análisis por citometría de flujo del contenido de ADN en tejido incluido en parafina es una combinación de secciones de tejido incluido en parafina y citometría de flujo (FCM) para medir el contenido de ADN y el análisis de ploidía. Esta combinación proporciona nuevas vías de investigación para aplicaciones clínicas de la citometría de flujo, especialmente en la investigación de tumores. FCM es el desarrollo integral y la aplicación de tecnología láser, electrónica, informática y de chorro de fluidos. Es una tecnología para el análisis cuantitativo rápido de células, que requiere que las células estén en estado suspendido. Actualmente se puede medir el tamaño celular, el volumen, el contenido de ADN, la tasa de síntesis de ADN, el contenido de ARN, los antígenos de superficie, los cromosomas, etc. Debido a las técnicas de preparación de muestras, muchos datos de análisis de flujo en el pasado se limitaban a muestras de tejido fresco. La técnica de preparar suspensiones de células dispersas mediante la realización de análisis FCM en secciones de tejido incluidas en parafina para detectar el contenido de ADN fue descrita por primera vez por Hedley et al. Se puede obtener un número suficiente de células individuales a partir de secciones de tejido y son muy similares en morfología y perfiles de contenido de ADN a las células individuales obtenidas de tejido fresco. En la actualidad, también se están realizando gradualmente investigaciones nacionales en esta área. Debido a que este método puede basarse en la observación o el diagnóstico patológico, es más preciso que la biopsia o la resección quirúrgica y también puede usarse para investigaciones y análisis retrospectivos. Además, la detección de ADN es rápida y los datos objetivos y fiables, lo que resulta de gran valor en el diagnóstico de tumores, predicción del pronóstico, respuesta al tratamiento, etc. Utilizando muestras anteriores, las suspensiones celulares se pueden preparar en lotes y probar en lotes en la computadora, evitando la influencia de diferentes estados de depuración del instrumento. El tiempo de almacenamiento de los bloques incluidos en parafina tiene poco impacto en los resultados.

Para la citometría de flujo se pueden utilizar bloques de tejido fijados convencionalmente (principalmente con formalina) e incluidos en parafina, pero las soluciones de fijación que contienen ácido pícrico o mercurio no son adecuadas. El espesor de corte apropiado es de 30 a 50 micras. Las secciones deben desparafinarse limpia y completamente; de ​​lo contrario, habrá muchos residuos en la suspensión celular preparada, lo que afectará la medición. Después de la hidratación con etanol en gradiente, se digiere con pepsina o tripsina. Después de la digestión, aparece en un solo estado disperso al microscopio. Dado que la fijación con formalina puede entrecruzar el ADN y las proteínas nucleares con valencia * *, afectando la unión química cuantitativa del ADN y los tintes, lo que resulta en una disminución en la intensidad de la fluorescencia, la proteasa puede destruir esta conexión y mejorar la calidad del diagrama de determinación. El tiempo de digestión es el adecuado para dispersar lo menos posible las células y los restos celulares. Los bloques de tejido no digeridos se filtraron a través de una malla de nailon de malla 100, se centrifugaron para eliminar el sobrenadante y luego se fijaron con alcohol al 70% enfriado con hielo y se colocaron a 4°C. Teñir antes de usar.

Los principales colorantes fluorescentes específicos del ADN son: (1) yoduro de propidio (PI); (2) bromuro de etidio (3) 4,6-diaminodifenilindol (DAPI); La detección por citometría de flujo del contenido de ADN en células y tejidos incluidos en parafina se puede utilizar como un nuevo método importante para el diagnóstico integral multiparamétrico basado en la morfología. Debido al costoso equipo y a los numerosos pasos de preparación de las muestras, los datos de medición pueden verse afectados, lo que limita su uso clínico generalizado.

Las muestras cortadas en parafina son la base de la tecnología morfométrica, que es una nueva tecnología de detección cuantitativa desarrollada en los últimos años. El analizador automático de imágenes realiza un procesamiento matemático de datos de imágenes, como la cantidad, el volumen, la longitud y el área de superficie de varios componentes formados en tejidos y células para analizar cuantitativamente la morfología y los componentes estructurales de los tejidos y células biológicos. Como el número de mitocondrias, el número de retículo endoplásmico, el área del núcleo y el citoplasma, el número de islotes pancreáticos y los valores de varias células, el número y la proporción de volumen de los corpúsculos renales, tinción de Feulgen in situ. cuantificación del ADN nuclear, etc. , haciendo que el estudio de histología y citología pase de la observación morfológica y cualitativa a la cuantificación morfológica. La medición morfológica consiste en obtener datos de imágenes bidimensionales de varias estructuras en secciones o frotis de tejido en parafina, así como fotografías de microscopía óptica y fotografías de microscopía electrónica del tejido, y obtener valiosos parámetros estructurales mediante el procesamiento de programas de software. Este tipo de datos tiene alta precisión, objetividad y repetibilidad, y puede reducir o compensar las diferencias subjetivas entre los observadores. La morfometría se ha aplicado en el diagnóstico clínico patológico, incluidas lesiones no neoplásicas y lesiones neoplásicas. La investigación nacional sobre enfermedades no neoplásicas ha incluido aterosclerosis, cirrosis hepática, hipertrofia prostática, cretinismo, pancreatitis y varicocele. El estudio de las lesiones tumorales es el foco de la morfometría en la investigación clínica. Actualmente, los principales tumores son los tumores del tracto digestivo, los tumores de hígado, los tumores de vejiga, los tumores de mama y los tumores de pulmón. Además, la combinación orgánica de parámetros morfométricos e indicadores de cambios funcionales durante el proceso de la enfermedad favorece la exploración de la patogénesis de la enfermedad. Los parámetros morfológicos también tienen valor de referencia para estimar el efecto del tratamiento y el pronóstico de las lesiones tumorales.

En el estudio de la morfometría lo primero que se requiere es la calidad de la muestra, como la contracción, expansión y extrusión del tejido, el espesor y dirección de las lonchas durante el proceso de producción, especialmente el tecnología de tinción de cortes. La tinción consiste en teñir los componentes de tejidos o células en diferentes colores para facilitar la identificación, mejorar la mensurabilidad de la imagen del componente a medir y la expresión de sus componentes internos, y hacer que el color y el brillo del componente a medir sean significativamente diferente de su fondo. Se pueden utilizar tinciones de rutina, tinciones especiales y tinciones inmunohistoquímicas para determinar cuantitativamente la morfología de diferentes componentes y reactivos coloreados. Las lesiones se tiñeron mediante inmunohistoquímica e hibridación in situ, seguidas de mediciones morfológicas cuantitativas. En segundo lugar, para descubrir los parámetros estructurales característicos o indicadores cuantitativos, primero se pueden detectar varios parámetros medibles de tejidos o células o diseñar algunos parámetros basados ​​en las características morfológicas de los componentes que se van a medir, y luego utilizar métodos estadísticos para descartar parámetros útiles. para la cuantificación. Debido al alto precio del instrumento, todavía se encuentra en la etapa de investigación experimental en China y es difícil que se utilice ampliamente en la práctica clínica. La aplicación de nuevos métodos de investigación integrales, como la tecnología morfométrica y la tecnología convencional, tiene un buen valor y efecto de aplicación.

Con la aparición de varios instrumentos nuevos y el establecimiento y uso continuo de nuevos métodos tecnológicos, la tecnología de corte en parafina se ha expandido gradualmente y ha penetrado en muchos campos nuevos, proporcionando una tecnología experimental o basada en muestras eficaz. Las secciones de tejido incluidas en parafina también se pueden utilizar para la hibridación in situ de moléculas de ácido nucleico, que pueden localizar y analizar moléculas de ADN hibridadas en el material u observar niveles de expresión génica (ARNm). Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa se pueden utilizar para el análisis de ADN de tejidos fijados e incluidos en parafina, llevando la investigación al nivel molecular, pero estas técnicas no se utilizarán de forma rutinaria en poco tiempo.