Hardcore|Notas de cultivo celular
Algunas células crecen mejor, tienen más células y crecen mejor. Generalmente pertenecen a células de crecimiento lento, como las células endoteliales. Algunas células, como los macrófagos y algunas células tumorales, crecen mejor en cantidades más pequeñas.
Los macrófagos crecen muy rápidamente y se adhieren a la pared muy rápidamente, por lo que debe quedar una pequeña cantidad de células en el canal, para que la condición celular sea mejor. Y prefiere crecer juntos, con espacios entre los montones. Si los dos crecen juntos, la morfología celular será pobre y las células envejecerán más, lo que será perjudicial para los resultados de experimentos posteriores.
Entonces, al cultivar células, es necesario explorar la densidad del espacio de crecimiento que prefieren las células.
¿Cómo puede ser mala la morfología celular?
Para las células adherentes, si la morfología celular no es buena o poco clara y parece haber materia extraña en la superficie, se pueden realizar las siguientes operaciones durante el paso:
Primer vertido Retire el medio de cultivo antiguo y agregue 3 ml de medio de cultivo nuevo (con o sin suero), lave una vez y succione con un gotero. Luego agregue 3 ml de medio de cultivo, sople previamente, controle la fuerza del soplado, páselo suavemente por el fondo del frasco y luego chúpelo. En este momento comenzará de nuevo la digestión oficial y la paliza. Sólo soplo macrófagos, no digestión.
En segundo lugar, agregue la suspensión celular soplada en un nuevo matraz de cultivo. Agregue medio de cultivo a la botella de cultivo con anticipación, colóquelo en la incubadora para cultivo y observe la adhesión celular en los momentos. Observar cada 10, 20 y 30 minutos. Seleccione un momento en el que algunas células se hayan adherido a la pared, colóquelo nuevamente sobre una mesa limpia, vierta rápidamente el medio de cultivo, con la parte inferior hacia arriba, agregue 3 ml de nuevo medio de cultivo y lave suavemente nuevamente. Luego agregue medio de cultivo completo para cultivo. Realice un seguimiento del crecimiento y la morfología celular. Yo lo llamo "segundo turno".
Si el efecto no es satisfactorio una vez, puedes repetirlo varias veces. Hasta que encontremos la forma celular perfecta. Preste atención a las condiciones de crecimiento que gustan a las células. Si prefieres que haya más células que crezcan bien, puedes esperar hasta tener más células adherentes. viceversa.
¿Cuánto medio de cultivo se debe añadir al frasco de cultivo?
Tienes que confiar en tus propias células para explorar esto. La pequeña botella de vidrio cuadrada no tiene 12 ml, pero la más grande tiene 14 ml. Algunas células crecerán mejor con menos medio de cultivo. Para las células que crecen rápidamente, la morfología celular será mejor si se agrega menos medio a las células que crecen fácilmente. Pero esté atento a los cambios.
¿Cómo elegir una botella de cultivo?
Las células de rápido crecimiento no crecen tan rápido como las botellas de vidrio en un ambiente relativamente "más cómodo". Entonces, para las células de crecimiento lento, si desea un estado celular más bonito, una botella de plástico sería mejor que una botella de vidrio, y para las células de crecimiento lento, una botella de vidrio sería mejor.
Del mismo modo, para el mismo tipo de células, las botellas de plástico son mejores cuando crecen a un ritmo más lento, como cuando se acaban de recuperar o están en cultivo primario. Cuando crecen vigorosamente, las botellas de vidrio son relativamente mejores.
¿Cómo digerir durante el tránsito?
Se puede decir que para las células que necesitan ser digeridas y subcultivadas, cada digestión es la prueba más importante para la supervivencia y condición de la célula.
Durante el proceso de digestión, después de añadir tripsina, todas las células serán digeridas por tripsina, pero hemos pasado por alto un problema. El estado de crecimiento de las células es diferente y la fuerza de adhesión de cada célula también es diferente. Más tarde mejoré mi método de digestión, al que llamé "método de digestión de cuatro pasos". Tomando como ejemplo las células no digeribles, las operaciones específicas son las siguientes:
Primero, sin agregar tripsina, vierta el medio de cultivo antiguo, agregue una pequeña cantidad de medio de cultivo nuevo y lave 1-2 veces. El objetivo es intentar eliminar las células muertas flotantes.
Luego agregue una pequeña cantidad de medio de cultivo nuevo y sople directamente. Esta vez, las células que no estén firmemente adheridas serán eliminadas. Lavar nuevamente con medio de cultivo, mezclar dos veces las suspensiones obtenidas e introducir en frascos nuevos. Puede ponerlos en una botella nueva para cultivo y compararlos con las células que luego fueron digeridas por tripsina para ver quién crece mejor, a fin de conocer la sensibilidad de las células a la tripsina.
Absorba el líquido restante en la botella, agregue aproximadamente 0,3 ml de tripsina para lavarlo una vez, deséchelo después de absorberlo y luego agregue aproximadamente 1 ml de tripsina para la digestión. Mientras digiere, observe bajo un microscopio.
Cuando los espacios entre las células sean obvios, succione inmediatamente la tripsina, limpie la bala y déjela a un lado, agregue nuevo medio de cultivo y comience a soplar. Después de soplar 2 o 3 veces, absorba la suspensión en un tubo de ensayo o en una botella nueva y guárdela temporalmente. Lavar con unos 2 ml de medio de cultivo nuevo y mezclar con el anterior. También puedes introducir una nueva cultura de botella para comparar el antes y el después.
Luego, vuelva a colocar en la botella la enzima pancreática que fue succionada frente a usted y continúe digiriendo las células restantes que están firmemente adheridas a la pared. Por supuesto, también puedes utilizar tripsina nueva. Continúe observando bajo el microscopio cuando los espacios celulares restantes sean obvios y las células sean independientes, retire la tripsina y agregue nuevo medio de cultivo. Introduzca la suspensión en un frasco nuevo para cultivo y contrólelo según su situación real.
De hecho, puede haber un quinto paso. Para las células que son particularmente difíciles de digerir y las células que son particularmente sensibles a la tripsina, puede continuar agregando el paso 5 o incluso el paso 6. Para que las células estén en mejores condiciones y luzcan más hermosas, no hay otra manera. Debes digerirlo varias veces en lotes para minimizar el daño causado por la tripsina a las células y asegurar el mejor estado de las células.
Por supuesto, si las células son fácilmente digeribles, como RAW264.7, entonces sólo se requiere el segundo paso. Los pasos 3 y 4 no son necesarios. Esto debe experimentarlo usted mismo durante el experimento. Se recomienda que cuando reciba una célula nueva, cultive las células digeridas en cada paso por separado y las compare para determinar la necesidad de tripsina de las células. Para facilitar sus experimentos posteriores.
Dividir la digestión celular en estos pasos, además de evitar el daño de las células por la tripsina, también tiene un papel más importante, que es hacer volar las células en un solo estado en la mayor medida, en lugar de conectarlas. en pedazos.
Porque cuando las células crecen, deben conectarse entre sí. La mayoría de las células crecen en fragmentos, especialmente las células adherentes. Cuando una sola célula crece después de la unión, se convierte en un parche. Pero si se trata de un trozo de células, las células no podrán adherirse a la pared después del paso y morirán. Por lo tanto, las células deben ser digeridas y subcultivadas en un estado único e independiente. Esto requiere mucho esfuerzo de tu parte.
Una vez que una célula ha caído en suspensión, es difícil soplarla en células individuales. Por lo tanto, las células deben explotarse antes de que se caigan, y el punto de tensión es donde las células se adhieren a la pared. Sea lo suficientemente digerible como para tragarlo fácilmente, pero no demasiado. Al soplar se caerá toda la pieza, y algunas pueden caerse individualmente. Es por eso que necesito agregar tripsina para la digestión por lotes para garantizar que las células con diferentes estados de crecimiento y niveles de adhesión puedan mantenerse en buenos puntos de estrés y dispersarse. Este es un punto muy importante.
Otro punto importante sobre el pase es que no se debe esperar hasta que las células estén llenas para digerirlas y pasar. Las células deben pasarse cuando crecen hasta aproximadamente el 70%. Una vez que se descubre que las células han crecido fuera de la capa, se deben digerir y pasar. No podemos demorarnos más.
Cómo limpiar las botellas al cambiar el fluido del canal
Para las células cultivadas en medio DMEM, si se lavan con 1640 sin suero, se lavarán mejor en momentos posteriores que si se lavan con DMEM las células crecen mejor. Asimismo, este fenómeno también existió en la cultura de 1640.
Si no molesta, puedes lavarlo con PBS. El efecto del lavado es básicamente el mismo que el del lavado con medio sin suero, pero es mejor para algunas células. El objetivo principal del lavado es eliminar el suero restante en el frasco de cultivo para evitar su impacto sobre la tripsina. Este es un punto clave para garantizar la prioridad de la digestión pancreática.
El lavado con PBS es un paso importante en el pasaje.
Las células se pueden digerir con PBS. Agregue PBS y déjelo reposar durante 10 a 15 minutos. Parte del tiempo es más largo. Cuando las células se separan una por una, se pueden eliminar directamente. Pero al igual que la digestión con tripsina, es necesario controlar el tiempo y no dedicar demasiado tiempo. De lo contrario, las células se dañarán, no sobrevivirán fácilmente y su condición se deteriorará fácilmente.
Este método es muy útil para determinadas células. Este método se puede utilizar cuando la tripsina no digiere fácilmente algunas células en células individuales o cuando la tripsina no está disponible temporalmente. Pero definitivamente pruébalo para ver si funciona para tus células.
Tema: Cultivo Celular