¿Cómo preparar la solución de cloruro de cesio necesaria para el experimento de separación en gradiente isopícnico?
Gradiente continuo
1. Mida el volumen de la solución de ADN, agregue CsCl sólido con precisión según la dosis de 1 g/ml, caliente la solución a 30 °C para ayudar a disolver. y revuelva la solución suavemente hasta que la sal se disuelva.
2. Agregue 0,8 ml de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml disueltos en agua) a cada 10 ml de solución de ADN; mezcle inmediatamente la solución de bromuro de etidio (flotando en la superficie) con la solución de ADN-cloruro de cesio; mezcla. La densidad final de la solución debe ser 1,55 g/ml (el índice de refracción de la solución es 1,3860). Las soluciones de almacenamiento de bromuro de etidio deben almacenarse en recipientes a prueba de luz (como botellas completamente envueltas en papel de aluminio) y mantenerse a temperatura ambiente.
3. Utilice el cabezal Sorvall SS34 (o su equivalente) para centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. La espuma de sarro que flota en la solución es un compuesto formado por bromuro de etidio y proteína bacteriana.
4. Utilice una pipeta Pasteur o una jeringa desechable con una aguja grande para transferir la solución roja transparente debajo de la espuma a un tubo de centrífuga. Llene el resto del tubo con aceite de parafina ligero y séllelo.
5. Centrifugar el gradiente de densidad obtenido a 20°C durante 16 h (rotor VTI 65), 45 000 rpm durante 48 h (rotor Ti50), 60 000 rpm durante 24 h (rotor Ti65) o 60 000 rpm (ti. 70,1 giro de cabeza). En condiciones generales de luz y trapezoidales, la zona superior suele estar compuesta de ADN bacteriano (cromosómico) lineal y ADN plasmídico circular mellado; la zona inferior está compuesta de ADN plasmídico circular cerrado; El precipitado de color rojo oscuro en el fondo del tubo de ensayo es un complejo de ARN de bromuro de etidio. Ubicado entre la solución de CsCl y el aceite de parafina hay un gradiente de bromuro de etidio de CsCl en un tubo de centrífuga de proteína Beckman con cierre rápido, que puede acomodar 4 mg de ADN plasmídico de círculo cerrado sin sobrecargar. Si hay más plásmido presente, se expandirá formando una banda ancha y se superpondrá con el ADN cromosómico. Este problema sólo surge cuando la replicación del plásmido alcanza niveles muy altos. Siempre que el extracto de plásmido se divida en dos gradientes, el problema se puede resolver. Esto sólo ocurrirá si toda la región de ADN se puede recolectar con altos niveles de rendimiento, en todo caso. Si se produce una sobrecarga, se puede recolectar toda la región del ADN, ajustar el volumen a 15 ml con solución de CsCl (ρ = 1,58 g/ml) y centrifugar el ADN nuevamente en dos tubos de centrífuga para alcanzar el equilibrio.
6. Recoge bandas de ADN. Inserte la aguja hipodérmica número 21 en la parte superior del tubo de ensayo, permitiendo que entre aire. Para minimizar la posibilidad de contaminación, primero recolecte la banda superior (ADN heterocrómico) usando una aguja hipodérmica numerada 18 de la siguiente manera: Limpie cuidadosamente el exterior del tubo con etanol para eliminar la grasa. Luego coloque un trozo de cinta adhesiva en el exterior del tubo. Inserte la aguja hipodérmica número 18 (con el bisel hacia arriba) en el tubo de ensayo de modo que la abertura biselada de la aguja quede justo debajo y paralela a la región del ADN cromosómico. Recoja el ADN pegajoso en un tubo desechable, selle el extremo de la aguja hipodérmica con un trozo de arcilla con forma y deje la segunda aguja en su lugar. Inserte la tercera aguja hipodérmica (65438) a través de la cinta Soctch.
Centrifugación isopícnica
1. Principio
La centrifugación isopícnica consiste en preparar el gradiente de densidad del medio con antelación antes de la centrifugación. Este líquido con gradiente de densidad contiene las densidades de todas las partículas de la muestra separada. La muestra a separar se extiende sobre el líquido del gradiente o se mezcla primero con el líquido del gradiente. Después de la centrifugación, el líquido gradiente forma gradualmente un gradiente de densidad con un fondo grueso y una parte superior delgada debido a la fuerza centrífuga. Al mismo tiempo, las partículas originalmente distribuidas uniformemente se redistribuyen. Cuando la densidad del medio en el fondo del tubo de ensayo es mayor que la densidad de las partículas, las partículas flotarán.
Cuando la densidad de las partículas en la parte superior de la curva es mayor que la densidad del medio, las partículas se asentarán y finalmente entrarán en una posición de densidad propia, es decir, la densidad de las partículas es igual al cambio de densidad de el medio. En este momento, las partículas ya no se moverán y formarán un área componente pura, que está relacionada con la densidad de las partículas de la muestra y no tiene nada que ver con parámetros como el tamaño de las partículas. Por lo tanto, mientras la velocidad de rotación y la temperatura permanezcan sin cambios, extender el tiempo de centrifugación no cambiará la posición de unión de estas partículas.
2. Nota:
① El tiempo de centrifugación es mayor.
(2) Está disponible el giro en ángulo o el giro horizontal.
(3) No debe utilizarse cuando la densidad de las partículas sea cercana o igual.
④La solución de gradiente de densidad debe incluir la densidad de todas las partículas.
⑤No utilices los frenos.
Cuarto, preparación de la solución de gradiente
(1) Principios de selección de materiales de gradiente:
1. No reacciona con materiales biológicos separados y es fácil de Separación de material biológico aislado.
2. Puede alcanzar el rango de densidad requerido. Dentro del rango de densidad requerido, la viscosidad es baja, la presión osmótica es baja y los cambios en la fuerza iónica y el pH son pequeños.
3. No corroerá los equipos centrífugos.
4. Fácil de purificar, barato o fácil de reciclar.
5.La concentración se determina fácilmente si tiene un índice de refracción.
6. Para analizar el centro de hiperconfusión es necesario conocer sus propiedades físicas y termodinámicas.
(2) Ámbito de aplicación de los materiales de gradiente La siguiente es una breve introducción al rendimiento y el ámbito de aplicación de varios materiales de gradiente de densidad comúnmente utilizados.
1. Sacarosa: alta solubilidad en agua, propiedades estables, alta presión osmótica y densidad de hasta 1,33 g/ml. Por ser barato y fácil de preparar, es un material de gradiente comúnmente utilizado en laboratorios para la separación de orgánulos, virus y ARN. Sin embargo, debido a su alta presión osmótica, no es adecuado para la separación de células.
2. Polisacarosa: el nombre comercial comúnmente utilizado es Ficoll-400, es decir, el peso molecular relativo es 400.000. Ficoll tiene una presión osmótica baja, pero una viscosidad extremadamente alta. Por lo tanto, a menudo se mezcla con diatrizoato de meglumina para reducir la viscosidad. Se utiliza principalmente para aislar diversas células, incluidas células sanguíneas, fibroblastos, células tumorales y células de hígado de ratón.
3. El cloruro de cesio es un medio de disociación altamente soluble en agua con una densidad de hasta 1,91 g/nd. Debido a que es una sal de metal pesado, el gradiente formado durante la centrifugación tiene buena resolución y se usa ampliamente para la separación de ADN, plásmidos, virus y lipoproteínas, pero es costoso.
4. Sales de halogenuros: Para separar lipoproteínas se pueden utilizar KBr y cloruro de sodio, mientras que para separar ARN se pueden utilizar yoduro de potasio y yoduro de sodio, con mayor resolución que las sales de cesio. Los gradientes de NaCl también se pueden utilizar para separar lipoproteínas y los gradientes de NaI pueden separar ADN nativo o desnaturalizado.
5. Este es un nombre comercial. Es un coloide de sílice recubierto con polivinilpirrolidona (PVP). Su permeabilidad es muy baja. Tiene poco efecto sobre los materiales biológicos y las partículas son estables. Tiene alta viscosidad y es inestable a pH ácido y alta fuerza iónica. Puede utilizarse para aislar células, orgánulos y virus.
5. Ultracentrifugación analítica
A diferencia de la ultracentrifugación preparativa, la ultracentrifugación analítica se utiliza principalmente para estudiar las características de sedimentación y la estructura de las macromoléculas biológicas, en lugar de recolectar un grupo específico. Rotores especiales y medios de detección para monitorear continuamente el proceso de sedimentación de materiales en un campo centrífugo.
Análisis del principio de funcionamiento de la ultracentrifugación;
El análisis de la ultracentrífuga se compone principalmente de un rotor elíptico, un sistema de vacío y un sistema óptico. El rotor está conectado al dispositivo de accionamiento de alta velocidad a través de un eje flexible, que gira para formar su propio eje. El rotor gira en la cámara de criovacío, que contiene dos cámaras: una cámara de análisis y una cámara de equilibrio con ventanas de tiempo de plano superior e inferior. El sistema óptico instalado en la centrífuga puede garantizar que los materiales de sedimentación en la cámara se puedan observar durante todo el proceso de centrifugación, y que los materiales de sedimentación se puedan monitorear mediante la absorción de luz ultravioleta (como proteínas, ADN) o la diferencia de refracción. índice. El último método funciona según el principio de que cuando la luz pasa a través de un líquido transparente con regiones de diferentes densidades, la luz se refracta en la interfaz de estas regiones.
La interfaz entre las partículas pesadas y ligeras en la cámara de análisis actúa como una lente refractiva, provocando que aparezca un "pico" en la película fotográfica del sistema de detección. A medida que continúa la sedimentación y avanza la interfaz, el "pico" también se mueve y se puede obtener un indicador de la velocidad de sedimentación del material a partir de la velocidad a la que se mueve el pico.