¿Cuáles son los principales métodos para extraer ARN viral?
1. Consulte los pasos detallados para extraer el virus de la influenza aviar (mencioné que no hay problema en realizar n tiempos de PCR cuantitativa):
1. control y control positivo Tubo de ensayo eppendorf estéril de 1,5 ml.
2. Agregar 600 microlitros de isotiocianato de guanidina, luego agregar la sustancia de control y la muestra, luego agregar 200 microlitros de cloroformo y mezclar por inversión.
3. Centrifugar a 13000 rpm durante 15 minutos
4 Al finalizar la centrifugación del paso 3, tomar el mismo número de tubos eppendorf y añadir 400ul de -20°C. alcohol isopropílico preenfriado.
5. Tome el sobrenadante centrifugado en el tercer paso (no inhale la capa blanca en el medio y trate de no inclinar el tubo de ensayo al sacarlo después de la centrifugación en el tercer paso), transfiéralo. al tubo de ensayo preparado en el cuarto paso e invertirlo Mezclar bien.
Centrifugar a 6,65438±03000 rpm durante 65438±05 minutos y verter suavemente el sobrenadante intentar secar el líquido sobre papel absorbente;
7. Añadir 600 μl de etanol al 75% e invertir varias veces para lavar el alcohol isopropílico restante.
Centrifugar a 7,65438±03000 rpm durante 65438±05 minutos, y verter suavemente el sobrenadante; tratar de secar el líquido sobre papel absorbente;
8. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 segundos, sacudir el líquido restante en la pared del tubo hasta el fondo, aspirarlo hasta secarlo con una pequeña cantidad de punta de pipeta y secar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. (no secar demasiado para evitar que el ARN se disuelva en el siguiente paso).
9. Agregue 20ul de agua DEPE (el agua pura depc de alta presión es agua DEPE), revuelva suavemente para disolver el ARN. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 segundos y almacenar en hielo para su uso posterior (preferiblemente dentro de 2 horas para evitar la degradación del ARN).
El segundo paso es extraer con TRIzol LS.
TRIzol LS extrae ARN viral
Los extractos son virus de suero, sangre, líquido de cultivo celular, líquido alantoideo de embrión de pollo y otros fluidos. La extracción debe realizarse cuando haya pocas personas para evitar la contaminación de ribonucleasa en el aire. Todo lo que se utilice también debe estar libre de RNasa.
1.1 Añadir 500ul de solución madre de virus al tubo de ensayo eppendorf de 1,5ml, luego añadir 500ul de trizol LS, mezclar bien y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
1.2 Añadir 200ul de cloroformo, tapar bien el tubo de centrífuga, agitar vigorosamente el tubo de centrífuga (la solución está totalmente emulsionada, de color blanco lechoso y sin separación de fases) y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos. (debido al bajo punto de ebullición del cloroformo y su alta volatilidad, el tubo de centrífuga debe agitarse ya que puede reventar, tenga cuidado).
Centrifugar 1.3 a 4°C, 13.000 rpm, 15 minutos, y transferir la fase líquida superior a otro tubo (evitar aspirar la fase intermedia blanca).
1.4 Añade un volumen igual de alcohol isopropílico, invierte suavemente el tubo de centrífuga para mezclar bien el líquido y déjalo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Centrifugar a 4°C, 65438±03000 rpm, 65438±0,5, 65438±05 minutos. (A primera vista, parece que no hay nada en el tubo. Si miras de cerca, encontrarás un pequeño precipitado blanco en la pared cerca del fondo del tubo. Esto es todo). Aspira con cuidado todo el sobrenadante con un pistola.
Lavar con 1,6 1 ml de etanol 75, centrifugar a 4°C, 8000 r/min, 10 min. (En este momento, encontrará que no hay nada en el tubo. No se preocupe, lo hay, pero es demasiado pequeño para verlo). Aspire con cuidado todo el sobrenadante con una pistola y colóquelo sobre una mesa limpia. secar durante 5 minutos.
1.7 Añadir la cantidad adecuada de agua tratada con DEPC. (Si la fuente de material es suficiente, la cantidad de agua agregada es la suma del siguiente RT menos la cantidad de otros reactivos; si desea usarlo con moderación, depende de usted. Trate de no agregar demasiada agua.
1.8 Se recomienda hacer RT inmediatamente.
Si desea guardarlo, puede agregar etanol en el paso anterior y congelarlo a -70°C. Se puede almacenar por un año si agrega agua DEPC, solo se puede almacenar a -20°C durante aproximadamente. un mes.
Tres. Método Trizol para extraer el virus de la influenza aviar
El método Trizol es adecuado para humanos, animales, plantas, tejidos microbianos o bacterias cultivadas, y el tamaño de la muestra varía desde decenas de miligramos hasta varios gramos.
1. Tome el líquido alantoideo de embrión de pollo, agregue de 5 a 10 veces el volumen de la solución de Trizol y mezcle bien.
2 Déjelo a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego agregue; 0,2 por cada 1 ml de solución de Trizol ml de cloroformo, tapar bien el tubo de centrífuga y agitar vigorosamente con la mano durante 15 segundos
3. alcohol isopropílico a razón de 0,5 ml de alcohol isopropílico por ml de solución de Trizol, colocar a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugar a 12.000 gramos
4. proporción de al menos 65.438 ± 0 ml por ml de solución TRIZOL, mezclar bien e incubar a 4°C Centrifugar a 7500g durante 5 minutos
5. 6. Deseche con cuidado el sobrenadante y séquelo a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos. Tenga cuidado de no secarlo demasiado, de lo contrario reducirá la solubilidad del ARN;
7. Luego disuelva el ARN en agua y déjelo por 10 minutos.
[Nota]
1. Usar mascarilla y guantes desechables durante todo el proceso y operar a la temperatura más baja posible.
2. La suspensión homogeneizada antes de agregar cloroformo se puede almacenar a -70 ℃ durante más de un mes. La precipitación de ARN en 70 etanol se puede almacenar a 4 ℃ durante una semana y a -20 ℃ durante una. año.
El genoma de los organismos eucariotas es ADN, ¿por qué no obtener directamente los genes que necesitamos a partir de la PCR del ADN? Debido a que los genes eucarióticos contienen una gran cantidad de regiones no codificantes, llamadas intrones, los segmentos que realmente codifican proteínas están separados por estos intrones, y estas regiones codificantes se denominan exones. El ADN eucariota se transcribe en ARN. Después de cortarlo y empalmarlo, estas regiones no codificantes se eliminan para formar ARNm maduro, que luego se traduce en proteína.
Por lo tanto, si el gen diana se obtiene directamente del ADN genómico de eucariotas y luego se clona y expresa, no es factible intentar obtener la proteína diana porque el ADN obtenido contendrá regiones no codificantes. La única forma de expresar genes eucarióticos y las proteínas correspondientes es extraer su ARNm y realizar RT-PCR.
1. Extracción de ARN
De hecho, el principio de extracción de ARN es muy simple: use un desnaturalizante para triturar células o tejidos, luego use cloroformo y otros solventes orgánicos para extraer el ARN. luego precipita, lava y seca. Finalmente se disuelve. Sin embargo, debido a la ubicuidad de la RNasa, el ARN puede degradarse en cualquier momento, por lo que hay muchas cosas a las que se debe prestar atención durante el experimento. Si no tiene cuidado, todos sus esfuerzos serán en vano.
1.1 Aislamiento de ARN de alta calidad
La síntesis exitosa de ADNc proviene de ARN de alta calidad. El ARN de alta calidad debe ser al menos completo y estar libre de inhibidores de la transcriptasa inversa como EDTA o SDS. La calidad del ARN determina la cantidad máxima de información de secuencia que se puede transcribir en ADNc. El método general de purificación de ARN es un método de un solo paso que utiliza isotiocianato de guanidina/fenol ácido.
El oligo(dT) normalmente no requiere aislamiento selectivo de ARN poli(A). Los resultados de la amplificación se pueden detectar independientemente de si la plantilla inicial es ARN total o ARN poli(A). Además, el aislamiento de ARN poli(A) puede provocar fluctuaciones en la abundancia de ARNm entre muestras, lo que da lugar a una detección y cuantificación de información sesgada. Pero al analizar ARNm raros, el ARN poli(A) aumentará la sensibilidad de detección.
El factor más importante que afecta a 1.2 la extracción de ARN: la ribonucleasa
En todos los experimentos de ARN, el factor más crítico es el aislamiento del ARN de longitud completa. La principal razón del fracaso del experimento fue la contaminación con ribonucleasa. Dado que la RNasa está muy extendida y es estable, y puede resistir una variedad de tratamientos sin ser inactivada, como hervir, esterilizar en autoclave, etc., las reacciones catalizadas por RNasa generalmente no requieren cofactores.
Por lo tanto, siempre que haya una pequeña cantidad de RNasa en la preparación de ARN, provocará la degradación del ARN durante el proceso de preparación y análisis. La pureza y la integridad del ARN preparado pueden afectar directamente los resultados del análisis de ARN. y el análisis son muy importantes. Es extremadamente difícil de operar.
En los experimentos, por un lado, se debe controlar estrictamente la contaminación de la RNasa exógena; por otro, se debe inhibir al máximo la RNasa endógena. La RNasa exógena existe en el sudor de las manos, la saliva, etc. También puede existir en el polvo. La ARNasa utilizada en otros experimentos de biología molecular también puede causar contaminación. Estas RNasas exógenas pueden contaminar instrumentos, productos de vidrio, productos de plástico, tanques de electroforesis, manos de investigadores y diversos reactivos. Sin embargo, varios tejidos y células contienen grandes cantidades de RNasa endógena.
1.3 Inhibidores de ribonucleasa comunes
Pirocarbonato de dietilo (DEPC): Es un inhibidor de ribonucleasa potente pero incompleto. Desnaturaliza las proteínas uniéndose al anillo imidazol de la histidina, el grupo activo de la ribonucleasa, inhibiendo así la actividad de la ribonucleasa.
*Isotiocianato de guanidina: Actualmente considerado el inhibidor de la RNasa más eficaz, no sólo puede disolver el tejido sino también inactivar la RNasa. No sólo puede destruir estructuras celulares y disociar ácidos nucleicos de proteínas nucleares, sino que también tiene un fuerte efecto desnaturalizante sobre la ribonucleasa.
* Complejo de ribonucleósido de oxovanadio: Complejo formado por iones de óxido de vanadio y nucleósidos, que se combina con la ribonucleasa para formar una sustancia de transición, que puede inhibir casi por completo la actividad de la ribonucleasa.
*Proteína inhibidora de la ribonucleasa (RNasin): glicoproteína ácida extraída de hígado de rata o placenta humana. La ribonucleasa es un inhibidor no competitivo de las ribonucleasas que puede unirse a una variedad de ribonucleasas para inactivarlas.
*Otros: SDS, urea, tierra de diatomeas, etc. También tiene cierto efecto inhibidor sobre la ribonucleasa.
1.4 Medidas para prevenir la contaminación por RNasa, así como precauciones y preparaciones necesarias antes de la extracción de RNA.
*El laboratorio debe establecer en la medida de lo posible un área dedicada a la operación de ARN, con centrífugas, pipetas y reactivos dedicados. El área operativa de la RNA debe mantenerse limpia y desinfectada periódicamente.
*Siempre se deben usar guantes y máscaras de goma desechables durante la operación y reemplazarlos con frecuencia para evitar que bacterias y hongos en manos y brazos, así como la ribonucleasa secretada por el cuerpo humano, ingresen a diversos contenedores o utensilios contaminados. Intenta evitar el uso de guantes de plástico de un solo uso. Los guantes de plástico no sólo suelen traer inconvenientes a las operaciones, sino que el exceso de partes de los guantes de plástico a menudo transfiere la RNasa del equipo a una contaminación en expansión libre de RNasa.
* Procura utilizar productos de plástico desechables y evita el uso de papel de filtro, puntas de pipeta, tubos de ensayo y otros equipos para evitar la contaminación cruzada. Por ejemplo, los investigadores que trabajan con sondas de ARN suelen utilizar RNasa H, T1, etc. , lo que es muy probable que cause contaminación de pipetas y centrífugas durante el funcionamiento. Y estos instrumentos contaminados son enemigos de la manipulación del ARN.
* Respecto a los productos de plástico desechables, se recomienda utilizar puntas y catéteres esterilizados de fábrica. Los productos de plástico estériles suministrados por la mayoría de los fabricantes tienen muy poca contaminación por ARNasa y pueden usarse directamente para operaciones de ARN después de la compra. Los productos plásticos tratados con DEPC suelen presentar RNasa debido a una contaminación secundaria, lo que lleva al fracaso experimental.
*Toda la cristalería debe secarse a 180°C durante 6 horas o más antes de su uso.
*Los utensilios que no se pueden tratar con DEPC se pueden limpiar varias veces con cloroformo, que suele eliminar la actividad de la ribonucleasa.
*Etanol, alcohol isopropílico, Tris, etc. Para preparar las soluciones se deben utilizar frascos de reactivos nuevos y sin abrir.
*Los utensilios de plástico se pueden remojar en agua con 0,1 DEPC o lavar con cloroformo (nota: no se pueden utilizar utensilios de vidrio orgánico porque el cloroformo los corroerá).
*El tanque de electroforesis de plexiglás se puede limpiar con jabón para platos, agua bidestilada, secar con etanol, luego remojar en 3 H2O2 a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego lavar con agua 0,1 DEPC y secar.
*La solución preparada debe tratarse con 0,1 DEPC a 37°C durante más de 12 horas.
A continuación, el DEPC residual se elimina mediante autoclave. Los reactivos que no se pueden esterilizar en autoclave deben prepararse con agua bidestilada estéril tratada con DEPC y luego filtrarse y esterilizarse con una membrana de filtro de 0,22 μm.
1.5 Pasos generales para la extracción de ARN
Los pasos generales para la extracción de ARN son: romper tejido → aislar ARN → precipitar ARN → lavar ARN → fundir ARN → preservar ARN.
La disrupción del tejido y la inactivación de la RNasa se pueden realizar simultáneamente. Se pueden usar clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, NP-40, SDS, proteinasa K, etc. para alterar el tejido y la β-ME puede inhibir la actividad de la RNasa.
Aislar la mitad del ARN utilizando disolventes orgánicos como fenol y cloroformo, y añadir una pequeña cantidad de alcohol isoamílico. Después de este paso, el ARN suele distribuirse en la capa superior y separarse de la capa proteica.
Normalmente se utiliza etanol, NaAc 3M (pH-5,2) o alcohol isopropílico para precipitar el ARN.
Lavar el ARN con etanol al 70%. A veces, este paso se puede omitir para evitar el lavado del ARN. El etanol después del lavado se puede secar o secar, pero no debe estar demasiado seco, de lo contrario no se disolverá fácilmente.
El TE se utiliza generalmente para fundir el ARN.
Almacenar el ARN lo más bajo posible. Para evitar trazas de contaminación por RNasa, el ARN aislado de muestras ricas en RNasa (como el páncreas y el hígado) debe conservarse en formaldehído para preservar el ARN de alta calidad, especialmente para el almacenamiento a largo plazo. El ARN extraído del hígado de rata se degradó básicamente después de almacenarse en agua durante una semana, mientras que el ARN extraído del bazo de rata permaneció estable después de almacenarse en agua durante tres años. Además, las transcripciones de más de 4 kb son más sensibles a la degradación por trazas de RNasa que las transcripciones pequeñas. Para aumentar la estabilidad de las muestras de ARN almacenadas, el ARN se puede disolver en formamida desionizada y almacenar a -70 °C. La formamida utilizada para preservar el ARN no debe contener impurezas que degraden el ARN. El ARN del páncreas se puede almacenar en formamida durante al menos un año. Cuando el ARN esté listo para su uso, se puede utilizar el siguiente método para precipitar el ARN: añadir NaAc a 0,3 M y centrifugar a 12000 xg durante 5 minutos.
Un nuevo método de extracción de ARN 1.6 - Método TRIZOL
El reactivo TRIZOL es un reactivo para la extracción de ARN total directamente de células o tejidos. Mantiene la integridad del ARN al alterar y lisar las células. Después de añadir cloroformo y centrifugar, la muestra se dividió en una capa acuosa y una capa orgánica. El ARN existe en la capa de agua. Después de recoger la capa acuosa superior, el ARN se puede reducir mediante precipitación con isopropanol. Después de eliminar la capa acuosa, el ADN y las proteínas de la muestra también se pueden reducir mediante precipitación. La precipitación con etanol puede precipitar el ADN en la capa media y el alcohol isopropílico precipita las proteínas en la capa orgánica. * * *El ADN purificado es útil para estandarizar la producción de ARN entre muestras.
TRIZOL es tóxico. Puede causar quemaduras si entra en contacto con la piel o se ingiere accidentalmente. En caso de contacto con la piel, lavar inmediatamente con abundante detergente y agua. TRIZOL es estable cuando se almacena a temperatura ambiente durante 12 meses. No obstante, para obtener mejores resultados, se recomienda mantenerlo entre 2 y 8 ℃
2. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
RT-PCR se refiere a la reacción de transcripción inversa; y se combinan la reacción de PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
2.1 Principio de la RT-PCR
La RT-PCR combina la síntesis de ADNc utilizando ARN como plantilla con la PCR, proporcionando un método rápido y sensible para analizar la expresión génica. La RT-PCR se utiliza para detectar o cuantificar información de expresión. Además, esta tecnología también se puede utilizar para detectar diferencias en la expresión génica o clonar ADNc sin la necesidad de construir una biblioteca de ADNc. La RT-PCR es más sensible y más fácil de realizar que otras técnicas de análisis de ARN, incluida la transferencia Northern, los ensayos de protección de ARNasa, la hibridación in situ y los ensayos de nucleasa S1.
La plantilla para RT-PCR puede ser ARN total o ARN selectivo poli(A). Las reacciones de transcripción inversa pueden utilizar la transcriptasa inversa, comenzando con cebadores aleatorios, oligo (dT) o cebadores específicos de genes (GSP). La RT-PCR se puede realizar en uno o dos pasos.
En la RT-PCR de dos pasos, cada paso se realiza en condiciones óptimas. La síntesis de ADNc se realizó primero en un tampón de transcripción inversa y luego se extrajo 1/10 del producto de reacción para PCR. En la RT-PCR de un solo paso, la transcripción inversa y la PCR se realizan secuencialmente en un tubo de ensayo en condiciones que optimizan tanto la transcripción inversa como la PCR.
2.2 pasos
(1) Agregue 4 uL de plantilla de ARN, 2 uL de cebadores y 5 uL de agua desionizada a un tubo de centrífuga bañado en hielo, mezcle uniformemente y centrifugue durante 3-5 segundos; /p>
⑵ Baño de agua a 70 ℃ durante 5 minutos, baño de hielo durante 30 segundos (en este momento el cebador y la plantilla están emparejados correctamente
⑶ Agregue 4 μl de solución de reacción 5x y 1); µl de agente inhibidor de ribonucleasa y 2 microlitros de DNTP (estos deben prepararse primero y luego colocarse en cada tubo de ensayo por separado) y mezclar;
⑶37℃ baño de agua durante 5 minutos, agregar 1uL de AMV-RT al revés transcriptasa y mezclar;
baño de agua a 5,37°C durante 1 hora (este paso es el proceso de transcripción inversa);
[6] Finalizar la reacción a 70°C durante 10 minutos (en este caso, inactivación de la actividad enzimática para evitar interferir con experimentos posteriores), coloque el producto en hielo para el siguiente experimento de PCR y almacene el resto a -70 °C.
2.3 Diseño de cebadores para rt-PCR
El diseño de cebadores de RT-PCR y el diseño de cebadores de PCR ordinarios pueden seguir los mismos principios. El diseño cuidadoso del cebador es el paso más importante en la PCR. Un par de cebadores ideal se hibrida sólo con una única secuencia a cada lado de la secuencia diana y no con otras secuencias. Los cebadores mal diseñados pueden amplificar otras secuencias no objetivo. Los cebadores ideales tienen las siguientes características, mientras que los cebadores fallidos tienen sus propias desventajas:
*Las longitudes típicas de los cebadores son de 18 a 24 nucleótidos. Los cebadores deben ser lo suficientemente largos para garantizar la unicidad de la secuencia y reducir la posibilidad de que la secuencia exista en sitios de secuencia no objetivo. Sin embargo, los cebadores de más de 24 nucleótidos no implican una mayor especificidad. Las secuencias más largas pueden hibridarse con secuencias no coincidentes, lo que reduce la especificidad, y son más lentas que las secuencias cortas, lo que reduce el rendimiento.
*Elija cebadores con un contenido de GC de 40 a 60 o un contenido de GC que refleje el contenido de la plantilla.
*Diseñar cebadores con un extremo G o C 5’ y una región media. Esto aumentará la estabilidad del cebador y la estabilidad de la hibridación entre el cebador y la secuencia objetivo.
*Evita la presencia de secuencias complementarias en el extremo 3’ del par de cebadores, que formarán dímeros de cebador e inhibirán la amplificación.
*Evitar las puntas 3’ ricas en GC. Al diseñar cebadores, asegúrese de que haya 3 A o T en los últimos 5 nucleótidos.
*Evitar el emparejamiento incorrecto del extremo 3’. El nucleósido terminal 3' necesita hibridarse con la plantilla para la extensión catalítica por parte de la polimerasa.
*Evitar la presencia de secuencias que puedan crear estructuras secundarias internas, que destruirán la estabilidad de hibridación de los cebadores.
Se pueden agregar secuencias adicionales no presentes en la secuencia diana, como sitios de restricción y secuencias promotoras, al extremo 5' del cebador sin afectar la especificidad. Estas secuencias no se incluyen al calcular los valores de Tm para los cebadores, pero se debe probar su complementariedad y estructura secundaria interna.
La estabilidad de la imprimación depende de las condiciones de almacenamiento. El polvo seco y la imprimación disuelta deben almacenarse a -20°C. Los cebadores disueltos en TE en concentraciones superiores a 10 μM son estables durante 6 meses cuando se almacenan a -20 °C, pero solo se pueden almacenar durante menos de 1 semana a temperatura ambiente (15 °C a 30 °C). La imprimación en polvo seco se puede almacenar durante al menos 65438 ±0 años a -20 °C y hasta 2 meses a temperatura ambiente (65438 ±05 °C a 30 °C).
2.4 Temperatura de recocido del cebador
Otro parámetro importante de los cebadores es la temperatura de fusión (Tm). Esta es la temperatura a la que el 50% del cebador y las secuencias complementarias aparecen como moléculas de ADN de doble hebra. Tm es necesario para establecer la temperatura de recocido de la PCR. Idealmente, la temperatura de hibridación es lo suficientemente baja para garantizar que el cebador pueda hibridarse eficientemente con la secuencia diana y lo suficientemente alta para reducir la unión no específica. La temperatura de recocido razonable es de 55 ~ 70 ℃. La temperatura de recocido generalmente se fija en 5°C por debajo de la Tm de la imprimación.
La Tm variará mucho dependiendo de la formulación y secuencia del cebador utilizado. Debido a que la mayoría de las fórmulas proporcionan un valor de Tm estimado, todas las temperaturas de recocido son solo un punto de partida. La especificidad se puede mejorar analizando varias reacciones con temperaturas de recocido que aumentan gradualmente. Inicialmente, estaba 5°C por debajo de la Tm estimada y la temperatura de recocido se incrementó gradualmente en incrementos de 2°C. Temperaturas de recocido más altas reducirán la formación de dímeros de cebador y productos no específicos. Para obtener mejores resultados, ambos cebadores deben tener valores de Tm similares. Si las Tm de los pares de cebadores difieren en más de 5 °C, mostrarán comienzos en falso significativos debido al uso de temperaturas de recocido más bajas en el ciclo. Si la Tm de los dos cebadores es diferente, ajuste la temperatura de recocido a 5 °C por debajo de la Tm más baja. Alternativamente, para aumentar la especificidad, se pueden realizar 5 ciclos a una temperatura de hibridación diseñada para una Tm más alta, y luego los ciclos restantes se pueden realizar a una temperatura de hibridación diseñada para una Tm más baja. Esto hace posible obtener copias parciales de la plantilla de destino bajo condiciones estrictas.
2.5 Incrementar la temperatura de transcripción inversa.
Una temperatura de mantenimiento más alta ayuda a abrir la estructura secundaria del ARN y mejorar el rendimiento de la reacción. Para la mayoría de las plantillas de ARN, almacenar el ARN y los cebadores a 65 °C sin tampón ni sal y luego enfriarlos rápidamente en hielo puede eliminar la mayoría de las estructuras secundarias y permitir que los cebadores se unan. Sin embargo, algunas plantillas todavía tienen estructura secundaria incluso después de la desnaturalización térmica. Las temperaturas de incubación más altas también pueden aumentar la especificidad, especialmente cuando se utilizan cebadores específicos de genes (GSP) para la síntesis de ADNc. Si utiliza GSP, asegúrese de que la Tm de los cebadores sea la misma que la temperatura de incubación esperada. No utilice oligo(dT) ni cebadores aleatorios por encima de 60 °C. Los cebadores aleatorios deben incubarse a 25 °C durante 65 438 ± 00 minutos y luego calentarse a 60 °C. Además de utilizar una temperatura de transcripción inversa más alta, la especificidad se puede mejorar cambiando directamente la temperatura de desnaturalización de la mezcla de ARN/cebador de 65 °C a la temperatura de transcripción inversa y agregando una mezcla de reacción 2X precalentada (síntesis de inicio en caliente de ADNc). Este enfoque ayuda a prevenir el emparejamiento de bases intermoleculares a bajas temperaturas. El uso de un instrumento de PCR puede simplificar los distintos cambios de temperatura necesarios para la RT-PCR.
2.6 Aditivos para promover la transcripción inversa
Se añaden aditivos, incluidos glicerol y DMSO, a la reacción de síntesis de la primera cadena para reducir la estabilidad de las dobles cadenas del ácido nucleico y desenredar el ARN. Estructura de nivel dúplex. Se pueden agregar hasta 20 glicerol o 10 DMSO sin afectar la actividad de MMLV. AMV también puede tolerar hasta un 20% de glicerol sin reducir su actividad. Para maximizar la sensibilidad de la RT-PCR en la reacción de transcripción inversa, se pueden agregar 10 g de glicerol y mantenerlo a 45 °C. Si se añade 1/10 del producto de transcripción inversa a la PCR, la concentración de glicerol en la reacción de amplificación es 0,4, lo que no es suficiente para inhibir la PCR.
A menudo se añaden inhibidores de la ARNasa a las reacciones de transcripción inversa para aumentar la duración y el rendimiento de la síntesis de ADNc. Los inhibidores de la RNasa deben agregarse en presencia de un tampón y un agente reductor (como DTT) en la reacción de síntesis de la primera cadena porque los procesos que preceden a la síntesis del ADNc desnaturalizan los inhibidores, liberando así el ARN unido que puede degradar las enzimas. Los inhibidores de la proteína RNasa solo pueden evitar que las RNasa A, B y C degraden el ARN, pero no pueden prevenir la RNasa en la piel, por lo que incluso si usa estos inhibidores, tenga cuidado de no introducir la RNasa con los dedos.
Usa transcriptasa inversa sin actividad RNasa (RNasaH-): La transcriptasa inversa cataliza la conversión de ARN en ADNc. Tanto M-MLV como AMV tienen RNasa endógena además de su propia actividad polimerasa. La actividad de la ARNasa compite con la actividad de la polimerasa para formar una cadena híbrida entre la plantilla de ARN y el cebador de ADN o la cadena de extensión de ADNc, degradando la cadena de ARN en el complejo ARN:ADN. La plantilla de ARN degradada por la actividad RNasa ya no se puede utilizar como sustrato eficaz para la síntesis de ADNc, lo que reduce el rendimiento y la duración de la síntesis de ADNc. Por tanto, sería beneficioso eliminar o reducir en gran medida la actividad RNasaH de la transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa MMLV basada en RNasa y la AMV basada en RNasa pueden obtener cantidades mayores y más longitud completa que MMLV y AMV.
La sensibilidad de la RT-PCR se verá afectada por la cantidad de ADNc sintetizado. El tamaño de los productos de RT-PCR está limitado por la capacidad de la transcriptasa inversa para sintetizar ADNc, especialmente cuando se clonan ADNc más grandes. La RNasaH-transcriptasa inversa puede aumentar significativamente el rendimiento de productos largos de RT-PCR al mismo tiempo que aumenta la estabilidad térmica, por lo que la reacción se puede realizar a temperaturas superiores a los 37-42 °C normales.
2.7 Tratamiento con Ribonucleasa h
Tratar la reacción de síntesis de ADNc con RNasa antes de la PCR puede mejorar la sensibilidad. Para algunas plantillas, se cree que el ARN en la reacción de síntesis de ADNc impedirá la unión del producto de amplificación. En este caso, el tratamiento con RNaseH puede aumentar la sensibilidad. Generalmente, se requiere tratamiento con RNasaH cuando se amplifican plantillas objetivo de ADNc largas y completas, como las de copia baja. Para esta difícil plantilla, el tratamiento con RNasa mejoró la señal generada por el ADNc sintetizado por AMV. Para la mayoría de las reacciones de RT-PCR, el tratamiento con RNasaH es opcional porque el paso de desnaturalización de la PCR a 95 °C generalmente hidroliza el ARN en complejos ARN:ADN.
2.8 Mejora de los métodos de detección de pequeñas cantidades de ARN
La RT-PCR es particularmente desafiante cuando solo hay pequeñas cantidades de ARN. Agregar glucógeno como portador durante el aislamiento de ARN puede ayudar a aumentar el rendimiento de muestras pequeñas. Puedes añadir glucógeno libre de RNasa al mismo tiempo que Trizol. El glucógeno es soluble en agua y puede mantenerse en la fase acuosa con el ARN para ayudar en la precipitación posterior. Para muestras de menos de 50 mg de tejido o 106 células cultivadas, la concentración recomendada de glucógeno libre de RNasa es de 250 μg/ml.
2.9 Comparación de RT-PCR de un paso y RT-PCR de dos pasos
La RT-PCR de dos pasos es más común y más útil cuando se utiliza una muestra para detectar múltiples ARNm . Sin embargo, la RT-PCR de un solo paso tiene otras ventajas. La RT-PCR de un solo paso es fácil de manejar cuando se procesan grandes cantidades de muestras y ayuda a reducir la contaminación residual porque no es necesario abrir las tapas de los tubos entre la síntesis y la amplificación del ADNc. El método de un solo paso puede lograr una mayor sensibilidad, alcanzando un mínimo de 0,1 pg de ARN total, porque se amplifica toda la muestra de ADNc. Para una RT-PCR exitosa en un solo paso, a menudo se utilizan cebadores específicos de genes antisentido para iniciar la síntesis de ADNc.
2.10 aumenta la especificidad de la RT-PCR.
Se pueden utilizar tres métodos diferentes para iniciar la síntesis de ADNc de primera cadena, y la especificidad relativa de cada método afecta la cantidad y el tipo de ADNc sintetizado.
El método del cebador aleatorio es el menos específico de los tres métodos. Los cebadores se hibridan en múltiples sitios a lo largo del transcrito, produciendo ADNc corto y de longitud parcial. Este método se utiliza a menudo para obtener secuencias del extremo 5' y ADNc que no pueden replicarse mediante la transcriptasa inversa a partir de plantillas de ARN con regiones de estructura secundaria o sitios de terminación. Para obtener el ADNc más largo, es necesario determinar empíricamente la proporción de cebadores y ARN en cada muestra de ARN. El rango de concentración inicial de cebadores aleatorios es de 50 a 250 ng por 20 µl de sistema de reacción. Debido a que el ADNc sintetizado a partir de ARN total utilizando cebadores aleatorios es principalmente ARN ribosómico, el molde generalmente es ARN poli(A).
Oligo(dT) es más específico que los cebadores aleatorios. Se hibrida con la cola poli(A) en el extremo 3' del ARNm que se encuentra en la mayoría de las células eucariotas. Debido a que el ARN poli(A) representa aproximadamente del 1 al 2% del ARN total, la cantidad y complejidad del ADNc es mucho menor que si se utilizaran cebadores aleatorios. Debido a su alta especificidad, el oligo(dT) generalmente no requiere optimización de la relación ARN-cebador ni selección de poli(A). Se recomienda utilizar 0,5 μg de oligo(dT) por 20 μl de sistema de reacción. Oligo(dT)12-18 es adecuado para la mayoría de RT-PCR. El sistema ThermoScript RT-PCR ofrece oligo(dT)20, que es adecuado para temperaturas de mantenimiento más altas debido a su buena estabilidad térmica.
Los cebadores específicos de genes (GSP) son los mejores cebadores para la transcripción inversa.
GSP es un oligonucleótido antisentido que se hibrida específicamente con la secuencia diana de ARN en lugar de aparearse con todo el ARN como cebadores aleatorios u oligo(dT). Las reglas utilizadas para diseñar cebadores de PCR también se aplican al diseño de GSP para reacciones de transcripción inversa. El GSP puede ser de la misma secuencia que el cebador de amplificación que se hibrida en el extremo 3' del ARNm, o el GSP puede diseñarse para hibridarse aguas abajo del cebador de amplificación inverso. Para algunos objetivos de amplificación, es necesario diseñar más de un cebador antisentido para que la RT-PCR tenga éxito porque la estructura secundaria del ARN objetivo puede impedir la unión del cebador. Se recomienda utilizar 1 pmol de GSP antisentido en un sistema de reacción de síntesis de primera hebra de 20 μl.
2.11 Aumentar la temperatura de transcripción inversa.
Para aprovechar al máximo la especificidad de GSP, se debe utilizar transcriptasa inversa con alta termoestabilidad. La transcriptasa inversa termoestable se puede incubar a temperaturas más altas para aumentar la rigurosidad de la reacción. Por ejemplo, si la temperatura de hibridación de un GSP es de 55 °C, entonces la especificidad del GSP no se puede utilizar completamente si se realiza una transcripción inversa de baja rigurosidad con AMV o M-MLV a 37 °C. Sin embargo, algunas transcriptasas inversas especiales pueden reaccionar a temperaturas de 50 °C o más, lo que eliminará productos no específicos producidos a temperaturas más bajas. Para obtener la máxima especificidad, la mezcla de ARN/cebador se puede transferir directamente desde la temperatura de desnaturalización de 65 °C a la temperatura de incubación de transcripción inversa. Esto ayuda a prevenir el emparejamiento de bases intermoleculares a bajas temperaturas. Las diversas conversiones de temperatura necesarias para la RT-PCR se pueden simplificar utilizando un instrumento de PCR.
2.12 Reducir la contaminación del ADN genómico
Una de las posibles dificultades que encuentra la RT-PCR es la contaminación del ADN genómico en el ARN. El uso de mejores métodos de aislamiento de ARN, como Trizol, reducirá la contaminación del ADN genómico en las preparaciones de ARN. Para evitar productos producidos por el ADN genómico, el ARN se puede tratar con ADNasa ⅰⅰ de grado de amplificación para eliminar el ADN contaminante antes de la transcripción inversa. Las muestras se incubaron en EDTA 2,0 mM a 65 °C durante 65.438 ± 00 minutos para terminar la digestión con DNasa II. El EDTA puede quelar iones de magnesio y prevenir la hidrólisis dependiente de magnesio del ARN a altas temperaturas.
Para separar el ADNc amplificado de los productos de amplificación del ADN genómico contaminantes, se pueden diseñar cebadores que se hibriden con los exones aislados. El producto de la PCR del ADNc será más corto que el producto del ADN genómico contaminado. Además, se realizó un experimento de control sin transcripción inversa en cada plantilla de ARN para determinar si un fragmento determinado derivaba de ADN genómico o ADNc. Los productos de PCR obtenidos sin transcripción inversa se derivaron del genoma.