Método para la determinación de la nitrato reductasa

Principio

La nitrato reductasa es una enzima clave en el metabolismo del nitrógeno de las plantas y está relacionada con la absorción y utilización del nitrógeno por los cultivos.

Sencillo y fácil de hacer, funciona en circunstancias normales.

Colorante azoico rojo. La alta acidez de la solución de reacción aumenta la velocidad de diazotización, pero reduce la velocidad de acoplamiento y el color es relativamente estable. Aumentar la temperatura puede aumentar la velocidad de reacción, pero reducirá la estabilidad de la sal de diazonio, por lo que la reacción debe llevarse a cabo en las mismas condiciones. Este método es muy sensible y puede determinar 0,5 microgramos de nitrito de sodio por mililitro.

Instrumentos y medicamentos

Espectrofotómetro 721 Bomba de vacío (o jeringa)

Balanza de caja caliente

Secador al vacío Taladro

Pajita de matraz Erlenmeyer

Vaso de precipitados

Tampón fosfato de 0,1 mol/L, pH 7,5 (ver Tabla 2).

Nitrato potásico 0,2 mol/L: Disolver 20,22 gramos de nitrato potásico en 1000 ml de agua destilada.

Reactivo de sulfonamida: añadir 1g de sulfonamida a 25ml de ácido clorhídrico concentrado, y diluir hasta 100ml con agua destilada.

Reactivo de α-Naftilamina: Disolver 0,2g de α-naftilamina en agua destilada que contenga 1ml de ácido clorhídrico concentrado y diluir hasta 100ml.

Solución estándar de nitrito de sodio: Disolver 1g de nitrito de sodio en agua destilada hasta 1000ml. Luego aspirar 5ml y agregar agua destilada para diluir a 1000ml. Esta solución contiene 25 microgramos de Nano por ml y debe diluirse a tiempo.

Procedimientos operativos

1...Limpiar las hojas frescas (ricino, tabaco, girasol, colza, trigo, algodón, etc.) con agua, secarlas con papel absorbente y luego taladre un disco con un diámetro de aproximadamente 1 cm, enjuáguelo dos veces con agua destilada, séquelo y luego pese dos hojas del mismo peso en una balanza de mesa, cada una de aproximadamente 0. Colóquelos en matraces Erlenmeyer de 50 ml que contengan las siguientes soluciones: (1) solución tampón de fosfato 0,1 mol/L (pH 7,5) 5 ml de agua destilada (2) solución tampón fosfato 0,1 mol/L (pH 7,5) 5 ml 0,2 mol/; LKNO3 5ml. Luego coloque el matraz Erlenmeyer en un desecador de vacío, conecte la bomba de vacío para extraer aire y el disco se hundirá en la solución después de desinflarlo (si no hay bomba de vacío, puede usar una jeringa de 20 ml, vierta la solución de reacción y deje la hoja). disco en la jeringa y use Bloquee el orificio de salida de la jeringa con el dedo y luego tire de la jeringa con fuerza para generar vacío, de modo que el aire del disco sea succionado y se hunda en la solución). Coloque el matraz Erlenmeyer en una incubadora a 30°C, protéjalo de la luz durante 30 minutos y luego aspire por separado.

Ten en cuenta que antes del muestreo, las hojas necesitan someterse a la fotosíntesis durante un período de tiempo para acumular carbohidratos. Si el contenido de carbohidratos del tejido es bajo, se reducirá la actividad enzimática. En este momento, se pueden añadir 30 µg de fosfato de 3-gliceraldehído o fructosa-1,6-bifosfato a la solución de reacción para aumentar significativamente la concentración.

Al final de los 30 minutos de incubación, extraer 65,438±0 ml de la solución de reacción en el tubo de ensayo, agregar 2 ml de reactivo de sulfonamida y 2 ml de reactivo de α-naftilamina, mezclar y agitar, dejar reposar durante 30 minutos y utilizar colorimétrico Utilice un medidor para realizar mediciones colorimétricas.

3.. Dibujar una curva estándar

Relacionada con la velocidad de diazotización y acoplamiento. temperatura, concentración de ácido, etc. Todos afectan la velocidad de desarrollo del color y la sensibilidad. Sin embargo, si el estándar y la muestra se miden en las mismas condiciones, la velocidad de desarrollo del color será la misma y se podrá comparar entre sí.

Pipe 1 ml de soluciones de NaNO2 de diferentes concentraciones (como 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 μ g/ml) en el tubo de ensayo, agregue 2 ml de reactivo de sulfonamida y 2 ml de reactivo de α-naftilamina y mezcle. Agite bien, déjelo reposar durante 30 minutos (o déjelo reposar en agua a cierta temperatura durante 30 minutos) y mídalo inmediatamente con un espectrofotómetro. Luego, tome la absorbancia como ordenada y la concentración de NaNO2 como abscisa. Dibuje una curva de absorbancia-concentración en un milímetro cuadrado de papel.

Trabajo experimental

1. Intenta comparar las actividades enzimáticas de diferentes plantas.

2. Antes del muestreo, intente comparar las diferencias en la actividad enzimática de las plantas en condiciones de luz u oscuridad.

Referencias

1. Chen Wei y Zhang Deyi: 1980. Extracción, determinación y purificación de nitrato reductasa de tejidos vegetales, Plant Physiology Letters, 1980 (4): 45-49.

2.Zhou Shu y Zheng Xiangmu: 1985. Discusión sobre el método de análisis in vivo de la nitrato reductasa, Plant Physiology Letters, 1985 (1): 47-49.

3. Huckabee: 1971. Métodos en enzimología, 23A: 491–503.

4.Radin.J.W.:1973. Fisiología vegetal, 51: 332–336.

5. Análisis colorimétrico, volumen 2, páginas 802-807

(Zhang Zhiliang, Universidad Normal del Este de China)