Conferencia científica | Comparación de tecnologías de secuenciación de genes de primera, segunda y tercera generación
La primera generación de secuenciación es el método de terminación de cadena didesoxi de ADN propuesto por Sanger y Coulson en la década de 1970, también conocido como secuenciación de Sanger. La primera secuencia del genoma (fago X174) se completó en 1977, con una longitud total de 5375 bases. El primer mapa del genoma humano, completado en 2001, se basó en un método de Sanger modificado.
Principio de secuenciación de Sanger: agregue una cierta proporción de DD NTP marcado (ddtp, ddCTP, ddGTP, ddTTP) a cuatro sistemas de reacción de síntesis de ADN (incluido dNTP) y luego realice electroforesis en gel y autorradiografía del ADN. La secuencia de la molécula a analizar se puede determinar en función de la posición de la banda de electroforesis. Dado que ni 2' ni 3' de ddNTP contienen grupos hidroxilo, no puede formar un enlace fosfodiéster durante la síntesis de ADN, por lo que puede usarse para interrumpir la reacción de síntesis de ADN.
Aunque la precisión de la secuenciación de primera generación es muy alta y esta tecnología todavía se usa ampliamente (como la construcción de vectores para clonación, eliminación de genes y otros experimentos), debido al bajo rendimiento, no es adecuados para la secuenciación a gran escala. Los fragmentos o exomas completos requieren mucho tiempo y, en muchos casos, son costosos.
La aparición de la tecnología de secuenciación de segunda generación, también conocida como tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS), ha mejorado el bajo rendimiento de la secuenciación de primera generación y puede secuenciar millones o incluso miles de millones al mismo tiempo. Las moléculas de ADN logran el objetivo de la secuenciación de alto rendimiento a gran escala. Cuando apareció por primera vez, existían principalmente la tecnología 454 de Roche, la tecnología Solid de ABI y la tecnología Solexa de Illumina. Estas tres tecnologías han mejorado enormemente el rendimiento de la secuenciación y han reducido en gran medida el costo y el ciclo de la secuenciación.
Entre ellos, Illumina se ha convertido en la empresa de secuenciación de segunda generación más popular gracias a su coste de secuenciación ultrabajo y su longitud de lectura aceptable. Su costo de secuenciación ha caído de varios miles de yuanes por 1G (1G son 100 millones de bases) en los últimos cinco años a más de 40 yuanes por datos 1G en la actualidad. En este proceso, se han promovido y aplicado ampliamente métodos experimentales como la secuenciación del genoma de novo, la secuenciación del transcriptoma, la secuenciación de ARN pequeño, la secuenciación de LncRNA, la secuenciación de circRNA, la secuenciación de la metilación del ADN, el mapeo genético de alta densidad y el análisis relacionado con GWAS a gran escala. En los últimos años, la tecnología NGS se ha desarrollado rápidamente y su aplicación ha avanzado a pruebas clínicas, como prenatales no invasivas, enfermedades genéticas, tumores (sólidos/sangre), etc.
Principio de Illumina: PCR puente + terminación reversible de fluorescencia de cuatro colores + imágenes de escaneo láser.
Pasos principales:
1. Preparación de la biblioteca de ADN: interrupción y enlace ultrasónicos.
2. Celda de flujo: adsorción de fragmentos de ADN que fluyen;
3. Puentear señales de amplificación por PCR y desnaturalización;
4. Secuenciación-secuenciación de bases en señales ópticas.
Aunque la tecnología de secuenciación de segunda generación es de alto rendimiento y de bajo costo, la longitud de lectura es demasiado corta. Los secuenciadores convencionales de Illumina solo pueden medir la longitud del PE150 en modo convencional y solo pueden depender de avances en algoritmos de software. Como resultado, la secuenciación de tercera generación ha pasado a la historia.
Existen dos tecnologías principales de secuenciación de tercera generación: SMRT de PacBio y la tecnología de secuenciación de molécula única de nanoporos de Oxford Nanopore Technologies. La longitud de lectura de secuenciación de estas dos tecnologías puede alcanzar decenas de kb, que es mucho mayor que la de la tecnología de secuenciación de segunda generación. En comparación con las dos generaciones anteriores, su característica más importante es la secuenciación de una sola molécula, que no requiere amplificación por PCR durante el proceso de secuenciación. Se consigue la secuenciación individual de cada molécula de ADN. La secuenciación de una sola molécula permite una detección más precisa de amplificaciones repetidas en tándem. Esto es de gran ayuda para la investigación de biología molecular en especies no participantes, y la longitud de lectura larga proporciona una gran comodidad para el empalme del genoma y la adquisición de secuencias genéticas de longitud completa.
El sistema de secuenciación en tiempo real de una sola molécula (SMRT) desarrollado por Pacific Biosciences aplica el principio de secuenciación durante la síntesis y utiliza chips SMRT como portadores de secuenciación.
Los principios básicos son los siguientes:
1. La polimerasa captura la secuencia de ADN de la biblioteca y la ancla en el fondo del orificio de la guía de ondas de modo cero
2. diferentes etiquetas fluorescentes ingresan aleatoriamente en la parte inferior del orificio de la guía de ondas de modo cero;
3. Los dNTP fluorescentes se irradian con láser para emitir fluorescencia y detectar la fluorescencia.
4. bases de la plantilla de ADN y se sintetizan bajo la acción de enzimas Una base;
5. Cuente el tiempo de existencia de la señal de fluorescencia, distinga las bases emparejadas y las bases libres, y obtenga la secuencia de ADN;
6. Durante la reacción enzimática, por un lado, la cadena se extiende y, por otro lado, el grupo fluorescente del dNTP se cae;
7.
Sin embargo, la tercera generación todavía no es una tecnología perfecta y su tasa de error de secuenciación es mucho mayor que la de la primera y segunda generación. Además, el rendimiento es mucho menor que el de la segunda generación, lo que resulta en un coste varias veces mayor que el de la segunda generación.
¿Hurun? Redacción publicitaria