Aplicación de la tecnología de fluorescencia
La aplicación de la tecnología de fluorescencia en la investigación de bioquímica y biología molecular incluye principalmente los siguientes aspectos:
1. Calificación de sustancias: diferentes sustancias fluorescentes tienen diferentes espectros de excitación y emisiones. La fluorescencia se puede utilizar para la identificación de sustancias. Los métodos de fluorescencia son más selectivos que los métodos espectroscópicos de absorción.
2. Determinación cuantitativa: el contenido de componentes fluorescentes en la muestra se puede analizar cuantitativamente utilizando la relación de que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentración de la muestra a una concentración más baja. Contenido de aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos. Una ventaja de la determinación cuantitativa por fluorescencia es la alta sensibilidad. Por ejemplo, el límite de determinación de vitamina B2 puede alcanzar 1 nanogramo/ml. Esta ventaja reduce en gran medida la cantidad de muestra necesaria para la determinación.
Este método de determinación cuantitativa también se puede aplicar a reacciones catalizadas por enzimas, siempre que haya un cambio en la intensidad de la fluorescencia antes y después de la reacción, se puede utilizar para determinar el contenido de enzima y la velocidad de reacción. la reacción enzimática.
3. Estudiar las propiedades físicas y químicas de las macromoléculas biológicas y su estructura y conformación molecular: espectro de excitación de fluorescencia, espectro de emisión, rendimiento cuántico y vida útil de la fluorescencia y otros parámetros no solo están relacionados con el cromóforo fluorescente intramolecular. Está relacionado con su propia estructura y también depende en gran medida del entorno alrededor del cromóforo, es decir, es muy sensible al entorno circundante. Esta característica se puede utilizar para estudiar las características y cambios del microambiente donde se encuentra el cromóforo fluorescente midiendo los cambios en los parámetros de fluorescencia mencionados anteriormente. En este estudio, además de utilizar los cromóforos fluorescentes de macromoléculas biológicas (como triptófano, tirosina, guanilato, etc., este tipo de fluorescencia se llama fluorescencia endógena), se pueden unir o adsorber algunos tintes fluorescentes especiales. cierta parte de las macromoléculas biológicas, y las macromoléculas biológicas se estudian midiendo los cambios en las características de fluorescencia de las moléculas de tinte. Dichas moléculas de tinte se denominan "sondas fluorescentes" y la fluorescencia que emiten se denomina generalmente fluorescencia exógena. La aplicación de sondas fluorescentes ha ampliado enormemente el ámbito de aplicación de la tecnología de fluorescencia en biología molecular.
4. El fenómeno de transferencia de energía en macromoléculas biológicas se puede estudiar utilizando parámetros como la vida útil de la fluorescencia y el rendimiento cuántico: a través del estudio de este fenómeno se puede obtener mucha información dentro de las macromoléculas biológicas, como la dos moléculas fluorescentes dentro de la molécula. La distancia crítica entre los grupos D y A se puede determinar según la fórmula de Förster (Famp;ouml;rster) se muestra en la fórmula (6):
Eso. es decir, los dos La tasa de transferencia de energía entre cromóforos fluorescentes KDA es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia crítica Ro entre ellos. KDA, K, J, etc. en la fórmula se pueden calcular a partir de la medición de la vida útil de la fluorescencia, el rendimiento cuántico y la intensidad de la fluorescencia, de modo que se pueda conocer la distancia entre los dos grupos.
En el pasado, la gente solía utilizar la polarización de fluorescencia como indicador para estudiar la dinámica de las macromoléculas biológicas. En los últimos años, la gente tiende a utilizar la decadencia de la polarización de la fluorescencia con el tiempo para estudiar estos problemas. En este método, la luz de excitación no es una luz polarizada plana continua, sino un pulso de luz polarizada, por lo que F∥ y F medidos son la atenuación de la fluorescencia polarizada en dos direcciones diferentes a lo largo del tiempo, que está relacionada con la vida útil de la fluorescencia τ. al movimiento de las moléculas en la solución, por lo que a menudo se expresa como F∥(t) y F⊥(t). De ellos se puede obtener una cantidad física muy importante: el parámetro de anisotropía A(t).
De A(t), podemos inferir la forma de las macromoléculas biológicas y el tiempo de relajación de la rotación molecular (es decir, el tiempo que tarda en pasar de un estado direccional a un estado no orientado), y luego Puede inferir el tamaño de las macromoléculas biológicas, la relación funcional entre el ángulo de rotación de las moléculas en solución y el tiempo. Estos resultados se pueden utilizar para estudiar las interacciones entre moléculas, la rigidez de la unión intermolecular, el grado de despolimerización de proteínas y moléculas de ácido nucleico, etc.
Además, la tecnología de fluorescencia también se utiliza mucho en inmunología. El más importante es el método de anticuerpos fluorescentes. Combinando ciertos tintes fluorescentes con anticuerpos séricos, los anticuerpos marcados aún pueden unirse específicamente al antígeno correspondiente y el complejo formado tiene propiedades fluorescentes, de modo que se puede determinar la presencia y el contenido del antígeno o anticuerpo.
5. Aplicación de tintes fluorescentes para secuenciación de ADN en el diagnóstico médico: La decodificación de secuencias de ADN es un requisito previo importante para la investigación en ingeniería genética en el nuevo siglo.
En los últimos años, han seguido surgiendo nuevas tecnologías y métodos para la secuenciación del ADN, y la tecnología de chips genéticos que etiqueta el ADN con tintes fluorescentes se ha convertido en la más llamativa. Los requisitos para los tintes fluorescentes utilizados en la tecnología de secuenciación de ADN marcado con tintes fluorescentes son: el espectro de absorción debe emitirse en la región de luz visible y el espectro debe estar lo más cerca posible de la región de luz roja para evitar interferencias de la fluorescencia azul de El ADN en sí puede emitir fluorescencia de suficiente intensidad y no debería afectar al ADN. El movimiento de los fragmentos en un campo eléctrico no es tóxico.
Los tintes fluorescentes utilizados actualmente para las secuencias de ADN son principalmente xantanos, compuestos de cianina, tintes de 1,8-naftalimida y tintes de difluoruro de dipirrolidina boro. La fluorescencia es principalmente amarilla, verde y roja, con mayor rendimiento cuántico de fluorescencia. .
6. Aplicación de la tecnología de fluorescencia en el diagnóstico médico: Pigmentos para terapia fotodinámica: Inyectan en el organismo materiales específicos sensibles a la luz. Se enriquecen en los tejidos tumorales y son metabolizados y eliminados por los tejidos celulares normales. Con una excitación luminosa adecuada, se pueden detectar lesiones cancerosas y luego se utiliza la excitación láser con longitudes de onda específicas para generar sustancias de radicales libres que pueden destruir el tejido tumoral o desencadenar la transformación de moléculas de oxígeno en oxígeno singlete que puede matar las células cancerosas para lograr el propósito de tratamiento. .
La terapia fotodinámica es el cuarto método de tratamiento de tumores además de la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia. Tiene pocos efectos secundarios y no causará daños a la apariencia. Dado que la terapia fotodinámica es altamente selectiva y destruye el tejido tumoral, la mayoría de los materiales fotosensibilizantes utilizados actualmente en la clínica son compuestos de porfirina. Debido al excelente desempeño de la terapia fotodinámica, se ha convertido en un punto de investigación en todo el mundo.