Introducción al análisis de fluorescencia
2 Fluorescencia de referencia en español
Nota El análisis de fluorescencia también se denomina análisis fotométrico de fluorescencia y es uno de los métodos de análisis fotoquímico. Método analítico que determina la concentración de una sustancia que se está midiendo en función de la intensidad de la fluorescencia producida por la irradiación de luz. Los ensayos fluorométricos se utilizan cada vez más en el análisis de compuestos orgánicos, especialmente en el estudio del metabolismo de fármacos in vivo.
Algunas sustancias, cuando se excitan con luz ultravioleta o luz visible, pueden emitir fluorescencia con una longitud de onda más larga que la luz de excitación. El espectro de excitación y el espectro de emisión de fluorescencia de una sustancia se pueden utilizar para el análisis cualitativo de la sustancia. Cuando se fijan condiciones como la intensidad, la longitud de onda, el disolvente utilizado y la temperatura, la intensidad de la luz emitida por una sustancia es proporcional a la concentración de la sustancia en la solución dentro de un cierto rango de concentración y se puede utilizar para análisis cuantitativos. Generalmente, la sensibilidad del análisis de fluorescencia es mayor que la de la espectrofotometría UV o la colorimetría. Las soluciones con una concentración demasiado alta tendrán un efecto de "autoextinción" y, dado que la solución cerca de la superficie del líquido absorberá la luz de excitación, la intensidad de. la luz emitida disminuirá, lo que dará como resultado la emisión. La intensidad de la luz no es directamente proporcional a la concentración, por lo que el análisis de fluorescencia debe realizarse en soluciones de baja concentración.
El instrumento utilizado es un fluorómetro o espectrofluorómetro. De acuerdo con las regulaciones de cada fármaco, seleccione la longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión y prepare la solución de referencia y la solución de prueba.
Dado que la intensidad absoluta de la fluorescencia es difícil de determinar, el método de análisis de fluorescencia utiliza una solución de referencia para medir el rango lineal de concentración bajo ciertas condiciones, y luego usa una solución de referencia de una cierta concentración para calibrar la instrumento antes de cada medición de sensibilidad; luego, bajo las mismas condiciones, lea las lecturas de la solución de referencia y su blanco de reactivo y la solución de prueba y su blanco de reactivo, y calcule la concentración de la muestra de prueba mediante la siguiente fórmula:
RRib
c =───────────Cr
Rr-Rrb
Fórmula
c es la concentración de la solución de prueba;
Cr es la concentración de la solución de referencia;
r es la lectura de la solución de prueba;
Rib es la lectura de la solución de prueba en blanco de reactivo;
Rr es la lectura de la solución de referencia;
Rrb es la lectura del blanco de reactivo de la solución de control.
Debido a que la linealidad entre la concentración y la lectura en el análisis de fluorescencia es estrecha, (R-RIB)/(RR-RRB) debe ser 0,50 ~ 2,0; si excede, la medición debe realizarse después de ajustar la solución; concentración.
Para especies que se descomponen fácilmente fotolíticamente, puede elegir una solución de material con longitudes de onda de luz de excitación y emisión y estabilidad de la luz similares, como una solución diluida de ácido sulfúrico de sulfato de quinina para fluorescencia azul y una solución fluorescente. de sulfato de quinina para fluorescencia de color amarillo verdoso, solución de sodio, solución de rodamina B para fluorescencia roja, etc. Primero compárelo con la solución de referencia para determinar la relación de lectura y úsela en lugar de la solución de referencia para calibrar la sensibilidad del instrumento.