¿Por qué el trizol no puede extraer el ARN?
1) ¿Hay algún problema con el núcleo de reactivo de Trizol?
2) Independientemente de que los materiales de investigación sean frescos, el ARN es fácil de degradar y debe almacenarse a 80 grados.
3) Si no hay ningún problema, ¿hay algún problema con su operación?
Pasos para la extracción de ARN con trizol: (solo como referencia)
¿Qué reactivos y materiales necesitan los usuarios?
Etanol absoluto, cloroformo, glucógeno (si es necesario), etc. ¿Tubo Eppendorf de 1,5 ml (sin ARNasa)? ¿Consejos (sin RNasa)?
¿Listo?
La ARNasa es muy estable y es la sustancia más importante que provoca la degradación del ARN. Puede inactivarse temporalmente bajo ciertas condiciones extremas, pero puede reactivarse rápidamente una vez que se eliminan los factores limitantes. Los métodos convencionales de esterilización con vapor a alta temperatura y alta presión y los inhibidores de proteínas no pueden inactivar completamente la RNasa. Está ampliamente presente en la piel humana, por lo que se deben usar guantes durante los experimentos de biología molecular relacionados con la preparación del ARN. ?
Otra fuente de contaminación por RNasa es el aspirador de líquido, que debe manipularse según los requisitos del fabricante del aspirador de líquido. Generalmente, se utiliza etanol 70 preparado a partir de DEPC para fregar el interior y el exterior del extractor de líquido, lo que básicamente cumple con los requisitos. Se deben usar guantes al manipular artículos libres de RNasa. ?
¿Procesamiento de materia prima?
Procura utilizar productos de plástico desechables esterilizados y productos de plástico etiquetados como libres de ARNasa. Si no se han abierto y utilizado, normalmente no es necesario volver a manipularlos. En principio, los productos de plástico nacionales deben ser transformados antes de su uso. Los pasos del procesamiento son los siguientes:
Vierta agua desionizada en el vaso de vidrio y agregue DEPC para obtener la concentración final de DEPC 0,1. Nota: DEPC es altamente tóxico y reactivo, así que tenga cuidado al usarlo en una campana extractora.
Colocar los productos plásticos tratados en un recipiente esterilizable a alta temperatura e inyectar la solución acuosa de DEPC para que todas las partes de los productos plásticos queden sumergidas en la solución. ?
Procesar durante la noche en campana extractora a temperatura ambiente.
Vierta con cuidado la solución acuosa de DEPC en la botella de desechos, selle el vaso que contiene los productos de plástico tratados con DEPC con papel de aluminio y esterilícelo con vapor de alta temperatura y alta presión durante al menos 30 minutos.
Cocer en el horno a temperatura adecuada hasta que se seque. Guárdelo en un lugar limpio para su uso posterior. ?
Los objetos de vidrio y metal se hornean a 250 grados centígrados durante más de 3 horas. ?
Extraer ARN total del tejido
Molido de nitrógeno líquido: Colocar el bloque de tejido directamente en el mortero, añadir una pequeña cantidad de nitrógeno líquido y triturar rápidamente. Cuando el tejido se ablande, añade una pequeña cantidad de nitrógeno líquido y vuelve a triturar, repitiendo este proceso tres veces. Agregue 50-100 mg de tejido/ml de Trizol y transfiéralo a un tubo de centrífuga para el segundo paso.
Homogeneización: Añadir 50-100 mg/ml de Trizol a la muestra de tejido. Además, el volumen del tejido no puede exceder 10 veces el volumen de Trizol; de lo contrario, el efecto de homogeneización será deficiente. Se necesitan entre 1 y 2 minutos para homogeneizar completamente con un homogeneizador eléctrico. ?
Extraer ARN total de las células
Cultivo celular adherente: no requiere digestión, se puede digerir y lisar directamente con Trizol, y se añade el volumen de Trizol en una proporción de 250px2 /ml.
Las células en suspensión se pueden recolectar y lisar directamente. Cada 1 ml de trizol puede lisar 5×106 células animales, vegetales o de levadura, o 107 células bacterianas. ?
¿Cuáles son los pasos?
Después de añadir Trizol a las células o tejidos, dejarlo a temperatura ambiente durante 5 minutos para que se disuelva por completo. Nota: En este momento, se puede almacenar a -70 ℃ durante mucho tiempo.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos y desechar el precipitado. ?
Añadir cloroformo según 200ul cloroformo/ml Trizol, agitar bien y dejar a temperatura ambiente durante 65438±05 minutos. Nota: El agitador está desactivado para evitar la fragmentación del ADN genómico.
Centrifugar a 12000g durante 15 minutos a 4℃.
Bombear la fase acuosa superior a otro tubo de centrífuga. Nota: Nunca absorba la interfaz intermedia; si extrae ADN y proteínas simultáneamente, almacene la fase baja en fenol en un refrigerador a 4 °C; si extrae solo ARN, deseche la fase baja en fenol.
Añadir alcohol isopropílico a razón de 0,5ml de alcohol isopropílico/ml de Trizol, mezclar bien y dejar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
Centrifugar a 12000g durante 10 minutos a 4°C, desechar el sobrenadante y dejar que el ARN se hunda hasta el fondo del tubo.
Añadir etanol 75 según 1ml de etanol 75/ml de Trizol, agitar suavemente el tubo de centrífuga y suspender el sedimento.
Centrifugar a 8.000g durante 5 minutos a 4°C y descartar la mayor cantidad de sobrenadante posible.
Secar al aire o al vacío a temperatura ambiente durante 5-65438±00 minutos. ? Nota: Las muestras de ARN no deben estar demasiado secas, de lo contrario serán difíciles de disolver.
Las muestras de ARN se pueden disolver en 50 ul de H2O, tampón TE o 0,5 SDS a 55-60 ℃ durante 5-65438 ± 00 minutos. Nota: H2O, te o 0,5SDS deben tratarse con DEPC y presurizarse.
La concentración cuantitativa de ARN se determina mediante D.O. Nota: El valor de A260/A280 extraído por este método está entre 1,6 y 1,8. Estimación del rendimiento: muestra de tejido: (ug de ARN/mg de tejido) 1-10 ug, células cultivadas; (ug ARN/106 células): 5-15ug.
Nota: Si la cantidad de tejido o células es demasiado pequeña, la dosis de Trizol se puede reducir según corresponda. Una dosis excesiva de tejido o células causará contaminación del ADN con ARN.
Tejidos; con alto contenido de proteínas, grasas o polisacáridos, Tejido muscular o tejido vegetal masivo, etc. , se debe homogeneizar o moler en nitrógeno líquido a 4°C? Centrifugar a 12000 g durante 10 minutos para eliminar la materia insoluble y luego realizar las siguientes operaciones. Si hay material graso en la capa superior, también hay que eliminarlo;
Se requieren guantes para extraer el ARN en los días calurosos, ya que las manos son la principal fuente de ARNasa;
Lo mejor es utilizar nitrógeno líquido para moler bloques de tejido. Si no se dispone de nitrógeno líquido o de un homogeneizador eléctrico, se puede utilizar un homogeneizador manual. En este momento, el bloque de tejido no debe ser demasiado grande. Utilice tijeras para cortar el tejido en álcali y luego tritúrelo bien. ?