Las condiciones de vida de los ratones desnudos atímicos
Actualmente, los ratones hembra nu/nu no se utilizan para criar ratones desnudos debido a su bajo rendimiento reproductivo. Generalmente, el apareamiento heterocigoto o los machos homocigotos recesivos se aparean con ratones hembra heterocigotos. Este método de apareamiento producirá descendencia con fenotipos normales y ratones desnudos en una proporción de 1:1.
Durante la reproducción, el gen nu generalmente se introduce en ratones C57BL/10. Cuando se introducen genes en cepas cogénicas, la hembra C57BL/10 generalmente se cruza con el macho C57BL/10-nu (cepa exógena). El método de apareamiento y los resultados son los siguientes:
La especie de rata utilizada por el Instituto de Control de Drogas de Beijing para criar ratones desnudos es BALB/C-nu/nu, que fue introducida desde Dinamarca en el Laboratorio Central de Animales. Instituto de Investigación de Japón en 1973. Después de continuar cultivándolo durante tres años, se entregó a Japan CLEA Co., Ltd. para su producción. Introducido por CLEA en 1980. Los ratones macho son ratones atímicos desnudos (BALB/C-nu/nu), y las hembras son ratones tímicos heterocigotos (BALB/C-nu/). Para la reproducción se utiliza el método de apareamiento aleatorio de BALB/C-nu/♀ y BALB/C-nu/nu♂, y se han logrado buenos resultados. El rendimiento de producción de ratones desnudos es bueno: la tasa de concepción es de 81,5 y la tasa de concepción es de 81,5. la tasa de camada promedio es de 8,1 lechones/camada. La tasa de natalidad promedio de cachorros desnudos es de 3,99 por camada, la tasa de supervivencia promedio de la camada es de 3,62 cachorros y la tasa de supervivencia de cachorros de 9 semanas es de 100. Los datos principales de su proyecto han sido. publicado con el Instituto Central de Investigación de Animales de Laboratorio (CLEA) de Japón y el Centro Británico de Animales de Laboratorio (LAC). Los materiales son básicamente los mismos. Debido a que los ratones desnudos carecen de células T y son susceptibles a infecciones bacterianas, virales y fúngicas, si se crían según los métodos animales convencionales, sólo unos pocos ratones desnudos pueden sobrevivir más de un mes, y no más de cuatro meses, si se los coloca en un aislante. Aquellos bien alimentados pueden sobrevivir más de un año. Por tanto, la vida útil de los ratones desnudos está estrechamente relacionada con las condiciones higiénicas del pienso. Por lo general, se crían primero en un aislamiento. Luego, el alimento se coloca en un entorno de barrera específico libre de patógenos.
La alimentación libre de patógenos requiere una barrera entre el animal y el mundo exterior. Cuanto más estrecha sea la barrera, más garantía habrá de alimentar a los ratones sanos. Sin embargo, si el tipo de barrera no se elige con cuidado, su efecto se verá comprometido. No hay garantías, por lo que debe seguir verificando si es elegible.
1． Equipo para alimentación de ratones desnudos sin condiciones patógenas
⑴Jaula de plástico con dispositivo de filtro de aire sellado. Cada jaula es una unidad en sí misma. Consiste en una jaula de plástico transparente estándar cubierta con material de filtración de aire. La zona entre ésta y la jaula estuvo sellada con cinta adhesiva durante varias semanas. Luego, esta jaula se puede colocar en un soporte para jaulas de laboratorio estándar. El material del filtro viene en forma de lámina y está hecho de fibra de poliéster ligeramente hilada (pero no tejida). Debe evitar que los microorganismos entren en la jaula desde fuera de la jaula.
Todo el conjunto de jaulas ha sido esterilizado mediante vapor a alta presión. A la hora de utilizarlo y gestionar la alimentación (como añadir agua y pienso, limpiar jaulas, destetar, etc.), todo debe realizarse en una funda protectora. Dentro de la campana hay aire filtrado a presión positiva. También es laminar (no turbulento) y unidireccional.
El método de operación con utensilios mencionado anteriormente es la forma más sencilla de mantener a los animales libres de patógenos.
⑵Aislador de animales. El dispositivo más utilizado está hecho de plástico de polietileno transparente, similar a una lámina blanda, pero también puede estar hecho de materiales como plexiglás, acero inoxidable, aluminio y nailon. Los productos terminados disponibles comercialmente tienen ciertas especificaciones y también pueden diseñarse y dimensionarse especialmente según las necesidades. Se trata de una cámara viva estéril que puede excluir cualquier microorganismo. El aire ambiente que entra y sale del dispositivo se filtra. Todos los alimentos y suministros se esterilizan y luego se introducen en el dispositivo a través de una cámara de entrada estéril para eliminar cualquier microorganismo. Inicialmente, se utilizan esterilizantes químicos y vapor a alta presión para esterilizar el dispositivo.
En un ambiente estéril, los ratones desnudos con el mismo origen genético y los ratones heterocigotos normales tienen una esperanza de vida similar. Sin embargo, Poiley et al. (1974) descubrieron que la tasa de supervivencia de los ratones recién nacidos en este entorno era menor que la de un entorno común. Para acercar la función de su tracto gastrointestinal a la normalidad, se propuso inocular ratones desnudos en un ambiente estéril con bacterias no patógenas (Poliey et al., 1974; Eaton et al., 1975).
Esto a menudo mejora el rendimiento reproductivo y facilita la transferencia de ratones libres de gérmenes desde los aisladores a condiciones menos favorables.
Para controlar el ambiente de la forma más eficaz e intentar conservar ratones desnudos estériles (o con una determinada flora), los aisladores son el equipo de almacenamiento ideal. Pero también tiene desventajas: requiere mucha mano de obra y el número de animales que se pueden criar en un espacio determinado es limitado.
⑶Dispositivo de flujo de aire laminar. Incluye cámaras, cubiertas y rejillas estándar. Cada conjunto de electrodomésticos forma un ambiente independiente, independiente del sistema de ventilación interior. Introduce aire filtrado por sí solo, inyecta completamente aire ultralimpio en la jaula de ardilla y lo descarga en forma de columna. Dado que cada conjunto de equipos es independiente entre sí y está protegido por aire a presión positiva, se pueden colocar en condiciones normales. Son portátiles, lo que permite un fácil mantenimiento y un máximo aprovechamiento de las instalaciones y equipos.
El éxito de la utilización de este método depende de la calidad de la gestión. Supervise de cerca la contaminación de la habitación y el movimiento del personal, y solo permita el ingreso de personal de tiempo completo a la habitación. Las jaulas para ratas deben mantenerse y mantenerse bajo presión positiva y condiciones de flujo de aire unidireccional, y todos los elementos (alimentos y otros elementos) que entren en contacto con los ratones deben esterilizarse. El agua potable debe ser tratada para eliminar las bacterias. Los trabajadores profesionales deben usar mascarillas quirúrgicas esterilizadas, gorros, guantes y abrigos largos. Al tocar a los animales, deben utilizar pinzas con puntas de goma en las puntas y deben estar desnaturalizadas con etanol (basta con dejarlas a un lado). inmersión.
⑷Cámara de flujo de aire laminar. Es diferente del pequeño laminador de aire mencionado anteriormente que se coloca en una habitación, pero todo el ambiente de la habitación está envuelto por aire filtrado a presión positiva. Durante el diseño, se debe instalar un interruptor para la entrada de aire y un indicador en la entrada de aire. El personal debe usar la misma ropa en el interior que la anterior. Para la esterilización de piensos, camas y jaulas utilizadas en interiores, se debe utilizar un esterilizador de vapor de alta presión con interruptores en ambos extremos.
Los métodos de introducción maximizan el uso de las instalaciones para la cría de animales. Aunque es costoso instalar una habitación de este tipo, la cámara de flujo de aire laminar y las estrictas restricciones en el acceso del personal pueden garantizar la producción sin problemas de ratones desnudos durante el período reproductivo. Es la mejor manera de criar ratones desnudos en grandes cantidades. Por ejemplo, debido a su adopción, la producción anual promedio de ratones desnudos en el Centro de Investigación del Cáncer de Frederick en los últimos cinco años (1973-1977) fue de más de 20.000.
2． Control ambiental
⑴Temperatura. La temperatura ambiente adecuada para los ratones desnudos es de 26 a 28 °C (78 a 820 F). Los ratones desnudos no tienen pelo y pierden temperatura corporal más rápidamente que los ratones con pelo. Al estar en un flujo de aire laminar continuo, disipan el calor más rápidamente y requieren una temperatura ambiente de aproximadamente 28°C (800F) para compensar. Generalmente, la temperatura interior del alimento se puede controlar a 25 ℃ ± 1 ℃. Si se mantienen en la misma jaula ratones desnudos y ratones heterocigotos peludos, la temperatura ambiente puede ser ligeramente más baja. Los ratones desnudos alimentados en una cámara de flujo laminar de aire continuo necesitan aumentar la temperatura en la cámara de flujo laminar a 28 °C.
⑵ Humedad. La temperatura relativa debe mantenerse entre 40 y 60 °C. En este momento, la pérdida de humedad de la piel de los ratones adultos desnudos es mínima. Una humedad demasiado baja es perjudicial para la supervivencia de los ratones desnudos recién nacidos, lo cual es particularmente importante en un entorno de flujo de aire laminar.
⑶Ventilación. En general, se cree que se requiere ventilación de 10 a 15 veces por hora y se debe utilizar un filtro de alta eficiencia (99,9) para garantizar una buena filtración del aire y eliminar partículas de más de 0,3 μm en el aire. La salida de aire también tiene un dispositivo de filtrado (también se puede utilizar de menor eficiencia) para evitar la contaminación cuando el aire regresa, y es necesario diseñar cómo reparar estos filtros desde el exterior.
En una cámara de flujo laminar, la presión positiva del aire es de al menos 0,65cmH2O. La dirección del flujo y la velocidad del aire deben controlarse de manera uniforme y libre. A medida que el aire filtrado pasa continuamente a través de la jaula del ratón, fluye hacia el entorno del animal, que en teoría actúa como una barrera para evitar la contaminación externa.
⑷Iluminación. Se debe mantener un ciclo de luz-oscuridad de 10 horas de luz y 14 horas sin luz todos los días. No se utilizan ventanas y se utiliza iluminación artificial para asegurar una iluminación constante durante todo el año, pero se debe evitar el exceso de iluminación fluorescente.
3. Jaula y ropa de cama
La jaula para criar ratones desnudos debe tener una superficie de suelo de 97 centímetros cuadrados (15 pulgadas cuadradas) y una altura de 12,7 centímetros (5 pulgadas). Debe seleccionarse para soportar una altura alta. Presión: Plástico esterilizable al vapor o acero inoxidable. La forma debe poder superponerse fácilmente para facilitar la esterilización y el almacenamiento.
Las jaulas de plástico transparente son mejores porque no es necesario abrir la tapa de la jaula para observar a los animales. La ropa de cama debe colocarse en el fondo de la jaula y no se deben utilizar redes.
La jaula debe limpiarse una vez a la semana o tratarse según sea necesario para garantizar un ambiente limpio y seco. Las jaulas u otros artículos que se limpien con detergente u otros detergentes deben enjuagarse bien. De lo contrario, se irritará la piel de los ratones desnudos.
El material de cama está en contacto directo con la piel de los ratones desnudos y no debe resultar irritante. Puedes utilizar astillas de madera dura que estén libres de polvo y trozos punzantes, tallos de maíz molidos o virutas de pino. Debe esterilizarse antes de su uso y solo puede usarse si no se forman grumos después de la esterilización.
Se puede utilizar algodón o papel de seda para construir un nido para ratones desnudos. Sin embargo, si la ropa de cama tiene una pulgada de espesor y la temperatura ambiente se controla correctamente para que el ratón desnudo se sienta cómodo, generalmente no hay necesidad de algodón o papel de seda.
4. Suministro de alimentos y agua
⑴ Alimentación. Las necesidades nutricionales de los ratones desnudos son similares a las de otras cepas de ratones. Por lo tanto, se puede utilizar cualquier alimento disponible comercialmente. Los alimentos deben esterilizarse. Los alimentos se pueden extender en una sola capa y colocar en un plato pequeño o en una bolsa perforada para la esterilización con vapor a alta presión (45 minutos, 120°C). Antes de la esterilización, se debe aumentar la dosis de nutrientes termolábiles (Williams et al., 1968). Además, se pueden complementar el pan integral y la leche para mejorar la fertilidad y prevenir el canibalismo (Poiley et al., 1974).
⑵Bebe agua. A veces, el agua del grifo contiene pequeñas cantidades de diversas bacterias no patógenas (incluida Pseudomonas rustii). Para evitar contaminar la población de ratones desnudos a través de fuentes de agua, algunas personas sugieren que el agua potable se superclore a 12 a 15 ppm o se acidifique con ácido clorhídrico para alcanzar un pH de 2,5 a 2,8, lo que puede lograrse. Controle eficazmente la tasa de contaminación, especialmente para ratones falsos. Contaminación por bacterias Cytozoon. Si las vitaminas se pierden excesivamente debido a la esterilización a alta presión, se pueden agregar multivitaminas al agua potable (por ejemplo, 1 ml de varias vitaminas por 1000 ml) y la mezcla se filtra y esteriliza a través de una membrana microporosa con un diámetro de 0,2 μm. La presión no debe exceder las 10 libras. Las mezclas de vitaminas y el agua deben analizarse adecuadamente para detectar ciertos cultivos bacterianos y las botellas de agua deben reemplazarse cada dos días. Las botellas de agua y los tubos para beber deben lavarse y desinfectarse entre usos.
El suministro de antibióticos a través del agua potable puede eliminar las bacterias del tracto gastrointestinal (Van Der Waaij, 1966). Además, se trata de una medida adicional para prevenir la contaminación externa que pueda producirse en ratones desnudos bajo un estricto control ambiental. Las cuatro formulaciones que utilizamos se muestran en la Tabla 4-4. Los siguientes antibióticos rara vez se absorben en el tracto digestivo. Cada fórmula debe cambiarse una vez por semana y rotarse cada cuatro semanas para reducir la aparición de cepas resistentes.
Si crías ratones desnudos libres de gérmenes en un entorno estrictamente controlado desde el principio, no necesitas utilizar antibióticos, porque añadir antibióticos aumenta la posibilidad de errores en las técnicas de cría.
5. Mantenimiento de cámaras de flujo de aire laminar
Las cámaras de flujo laminar desde el suelo hasta el techo y los equipos deben mantenerse libres de polvo y residuos. La esterilidad de la habitación debe comprobarse cada mes colocando una placa plana por metro cuadrado para comprobar el número de bacterias en el aire interior. Las normas para la inspección de bacterias caídas varían de un país a otro. Además, la cantidad de bacterias caídas no debe exceder el límite y no debe haber bacterias patógenas presentes. De lo contrario, se requiere una nueva desinfección (consulte la tabla a continuación).
Regulaciones sobre el límite de caída de bacterias en cámaras de flujo laminar en varios países
Especificar unidad de placa medio de cultivo tiempo de exposición (min) tiempo de cultivo (h) temperatura límite de caída de bacterias (piezas ) Agar ordinario japonés 54837 ℃ lt; 5 Agar sangre americano 104837 ℃ lt; 3 Agar sangre de laboratorio de Beijing 304837 ℃ lt; 10 Es mejor esterilizar en autoclave todos los equipos móviles y los dispositivos inmóviles (como paredes, pisos, techos, etc.). esterilizado con fenoles líquidos. Para una limpieza profunda con desinfectantes, la desinfección debe repetirse tres veces. Después de la desinfección, la habitación debe sellarse y analizarse para detectar contaminación microbiológica después de 48 horas. Si la prueba es negativa, se permite su uso. El personal debe usar un juego completo de batas quirúrgicas esterilizadas y botas esterilizadas antes de ingresar.
En resumen, se deben seguir todos los requisitos para producir ratones desnudos; de lo contrario, la prueba no tendrá éxito.
Problemas a los que se debe prestar atención al criar ratones desnudos con alimento:
⑴Establecer un sistema de barrera es una condición importante para criar ratones desnudos con alimento. Los ratones desnudos carecen congénitamente de timo, tienen un sistema inmunológico imperfecto, carecen de resistencia a factores extraños y son extremadamente susceptibles a la infección por patógenos. En un entorno convencional, solo pueden sobrevivir unos pocos meses como máximo. alimentados en un entorno alimentario de aislamiento libre de patógenos. Según la situación actual en nuestro país, no es posible construir más instalaciones experimentales con animales de alto nivel, pero es factible modernizar los edificios existentes. Aunque la sala de cría de barrera renovada es relativamente simple en comparación con los países tecnológicamente desarrollados, básicamente cumple con los requisitos de las instalaciones del sistema de barrera, reduce en gran medida el costo y permite la cría normal de ratones desnudos.
⑵ El mejor método de reproducción para ratones desnudos es utilizar ratones machos homocigotos recesivos (nu/nu) y hembras heterocigotas (nu/ ) para el apareamiento. Debido a que los ratones machos homocigotos recesivos generalmente pueden reproducirse normalmente, la proporción entre su descendencia y los ratones desnudos y la descendencia normal es de 1:1; todos los descendientes normales son heterocigotos. Cuando estos ratones se utilizan como controles experimentales, se observaron claramente diferencias diferenciales entre homocigotos y heterocigotos. . Los otros dos métodos de cría de ratones desnudos tienen ciertas desventajas, por ejemplo, cuando se utilizan ratones machos y hembras heterocigotos (nu/) para aparearse, la proporción entre ratones desnudos y crías fenotípicamente normales es de 1:3. ratones desnudos, y los ratones normales criados pueden ser ratones con genes nu/ o /, lo cual es difícil de distinguir a menos que sea mediante reproducción. Otro ejemplo es utilizar ratones machos y hembras homocigotos recesivos (nu/nu) para aparearse y reproducirse. Aunque todas las crías son ratones desnudos, este método de reproducción no es muy eficaz porque las hembras desnudas tienen baja fecundidad y requieren muy pocos cuidados. difícil.
⑶La clave para la supervivencia de las crías de ratones después del nacimiento es la lactancia. Si no se presta atención a la lactancia, la tasa de mortalidad de los ratones desnudos durante la lactancia será alta. La razón principal es que los ratones homocigotos de pelo mixto de la misma camada se desarrollan rápidamente, son grandes, fuertes y altamente competitivos. Compiten con los ratones homocigotos desnudos por la leche materna, lo que afecta el desarrollo de los ratones homocigotos desnudos y les provoca demacración. y morir. Para mejorar la velocidad de crecimiento y desarrollo y la tasa de supervivencia de los ratones desnudos, se amamantó por separado a ratones desnudos homocigotos y heterocigotos, y las hembras fueron alimentadas con piensos ricos en proteínas y vitaminas.
⑷Para mantener una reproducción y crecimiento normal a largo plazo, se deben establecer métodos de seguimiento microbiano para controlar la calidad. Debido a la función inmune defectuosa de los ratones desnudos, son susceptibles a la infección por microorganismos, virus y parásitos, especialmente la infección por el virus de la hepatitis del ratón. Una vez que un ratón desnudo se infecta con hepatitis de ratón, los ratones desnudos de la camada desarrollarán la enfermedad. entre 36 y 134 días después del nacimiento El cielo murió uno tras otro, nadie se salvó. El hígado de los ratones enfermos sufre cambios parecidos al mármol, es duro, amarillo, áspero, nodular y tiene bordes irregulares. Existe una gran amenaza para la cría de ratones desnudos. En la alimentación de ratones desnudos, el llamado "síndrome de emaciación" suele ocurrir. De hecho, está estrechamente relacionado con la infección por hepatitis viral murina, una de las enfermedades comunes de los ratones desnudos. cesárea.
Al utilizar métodos de examen microbiológico, se deben considerar las características fisiológicas de los ratones desnudos. Los ratones desnudos son animales con funciones inmunes deficientes después de la infección con el virus de la hepatitis del ratón, el virus Sendai, etc., no se producen anticuerpos. el suero. Por lo tanto, sólo se puede comprobar el estado de los anticuerpos en el suero de ratones heterocigotos del mismo feto, o aislar directamente el patógeno, o inocular el tejido hepático de ratones desnudos en los ratones heterocigotos y luego utilizar métodos serológicos para medir los anticuerpos correspondientes. Por lo tanto, el método de inspección para algunos virus patógenos y patógenos de Taizaki en ratones desnudos es principalmente verificar la producción de anticuerpos en el suero de ratones heterocigotos para determinar si los ratones desnudos están infectados por estos patógenos.