¿Cuáles son los métodos para el cultivo a gran escala de células animales?
Dependiendo del tipo de células animales, se pueden utilizar cultivos en monocapa, cultivos en suspensión y cultivos inmovilizados para cultivos a gran escala.
1. Características de crecimiento y temperatura de cultivo de las células animales.
1. Las células crecen lentamente y se contaminan fácilmente, y se requieren antibióticos para su cultivo.
2. Las células son de gran tamaño, no tienen pared celular, tienen baja resistencia mecánica y escasa adaptabilidad ambiental.
3. Requiere menos oxígeno y no tolera una fuerte ventilación y agitación.
4. Efecto del crecimiento de la población, crecimiento del apego (dependencia del anclaje)
5. Los productos durante el proceso de cultivo se distribuyen dentro y fuera de las células y el costo es alto.
6. Las células cultivadas primarias suelen degenerar y morir después de 50 generaciones.
Las células animales se pueden dividir en dos tipos en función de su dependencia de los sustratos de crecimiento en cultivo in vitro:
Células dependientes de la adhesión: sólo pueden unirse a células cargadas adecuadamente. crecer en superficies sólidas o semisólidas. La mayoría de las células animales, incluidas las células de tejidos no linfoides y muchas células aneuploides, entran en esta categoría.
Células independientes de la adhesión: Pueden crecer sin adhesión a superficies sólidas, incluida la sangre, las células del tejido linfoide, muchas células tumorales y algunas células transformadas.
La temperatura óptima para las células cultivadas es equivalente a la temperatura normal de diversas células o tejidos. La temperatura óptima para el cultivo de células humanas y de mamíferos es de 35 a 37 °C. Si la temperatura se desvía de esta temperatura, el metabolismo normal y el crecimiento de las células se verán afectados o incluso morirán. En general, las células cultivadas son más tolerantes a las bajas temperaturas que a las altas. Cuando la temperatura no supera los 39°C, la intensidad metabólica de las células es proporcional a la temperatura; las células cultivadas a 39~40°C durante 65,438±0 horas sufrirán un cierto grado de daño, pero aún pueden recuperarse. Cuando la temperatura supera los 43°C, muchas células morirán. Cuando la temperatura desciende a 30~20°C, el metabolismo celular disminuye, por lo que disminuye el intercambio de material con el medio de cultivo. Lo primero que se observa son los cambios morfológicos de las células y el desprendimiento de las células de la matriz. Cuando los cultivos regresan a la temperatura de cultivo inicial, su morfología y metabolismo originales también regresan a sus niveles originales.
En segundo lugar, el cultivo monocapa (cultivo adherido)
Se refiere al cultivo de células adheridas a una superficie sólida.
1. Características de crecimiento: Las células adherentes deben adherirse a la pared del recipiente de cultivo (frasco) durante el cultivo. Una vez que las células se adhieren a la pared, se propagarán rápidamente, luego comenzarán la mitosis y entrarán rápidamente en la fase de crecimiento logarítmico. Generalmente, después de unos días, se cubre la superficie de cultivo y se forma una monocapa celular densa.
2. Ventajas del cultivo en monocapa:
Es fácil reemplazar el medio de cultivo; las células están firmemente adheridas a la superficie de la fase sólida, el medio de cultivo antiguo se puede verter directamente. Y el nuevo medio de cultivo se puede utilizar directamente después de la limpieza.
El cultivo de perfusión es fácil de utilizar para aumentar la densidad celular porque las células están inmovilizadas en la superficie, no se requiere ningún sistema de filtración;
Cuando las células se adhieren a una matriz de crecimiento, muchas células expresarán un producto de forma más eficiente.
El mismo dispositivo se puede utilizar con diferentes proporciones de medios/celdas.
Aplicable a todo tipo de células.
3. Desventajas del cultivo de una sola capa: en comparación con el método de cultivo en suspensión,
el entrenamiento externo es más difícil y requiere una gran inversión
; área grande;
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No se puede controlar eficazmente el crecimiento celular;
4. Superficie de adhesión celular: requiere carga neta positiva y alta actividad superficial. Para los microportadores también se requiere una cierta densidad de carga; si es una superficie orgánica, debe ser hidrófila y estar cargada positivamente.
5. Sistema de cultivo monocapa: incluye principalmente matraz giratorio, fibra hueca (descrito más adelante), perlas de vidrio y sistema de microportador (descrito más adelante).
Sistema de cultivo en matraz agitado: en primer lugar, utilice el sistema de matraz agitado para cultivar células dependientes del anclaje. El cultivo en matraz giratorio se utiliza generalmente en la fase de transición del cultivo a pequeña escala al cultivo a gran escala, o como una forma de preparar células para la inoculación en biorreactor. Las células se inoculan en una incubadora cilíndrica giratoria: un matraz giratorio. Durante el proceso de cultivo, el matraz giratorio se gira continuamente para que las células estén en contacto alternativo con el medio de cultivo y el aire, proporcionando así mejores condiciones de transferencia de masa y de calor.
El cultivo en botellas giratorias tiene las ventajas de una estructura simple, baja inversión, tecnología madura, buena repetibilidad y fácil expansión al aumentar el número de botellas giratorias.
Sin embargo, también tiene sus desventajas: alta intensidad de mano de obra, gran ocupación de espacio, pequeña superficie por unidad de volumen para el crecimiento celular, baja densidad de crecimiento celular y monitoreo y control limitados de las condiciones ambientales durante el proceso de cultivo. En la actualidad, el sistema de cultivo con centrifugadora incluye dos tipos: incubadora de dióxido de carbono y centrifugadora.
Cultivo monocapa en reactor En este modo de cultivo, las células crecen sobre una superficie fija y no fluirán con el medio de cultivo debido a la agitación. Por lo tanto, es más fácil reemplazar el medio de cultivo y no se requiere equipo especial. Las células se separan del medio de cultivo y se puede utilizar el cultivo de perfusión para obtener una alta densidad celular y se pueden obtener productos de forma eficaz; sin embargo, es difícil ampliar la escala y no se puede controlar directamente el crecimiento de las células. para preparar productos biofarmacéuticos de alto valor y en pequeñas dosis.
Los reactores CelliGen, CelliGen PlusTM y Bioflo3000 son biorreactores de cultivo monocapa de uso común, que se pueden utilizar para el cultivo celular en monocapa y tienen un sistema de agitación de cesta y un soporte de disco. Este portador es un disco de fibra de poliéster no tejido de 6 mm de diámetro con una alta relación área superficial/volumen (1200 cm2/g), lo que facilita altas densidades celulares. El sistema de agitación en cesta y el cultivo portador son actualmente los métodos más utilizados para el cultivo de células adherentes y se utilizan para células de hibridoma, células Hela, células 293, células CHO y otras células. Las células cultivadas de esta manera pueden adherirse a la pared rápidamente después de la inoculación.
3. Cultivo en suspensión
Se refiere al proceso en el que las células crecen libremente suspendidas en un reactor. Se utiliza principalmente para el cultivo de células sin dependencia de unión, como las células de hibridoma, se desarrolla sobre la base de la fermentación microbiana;
El cultivo en suspensión libre de suero es un método de cultivo celular que sustituye el suero animal por proteínas u hormonas conocidas de origen humano o animal. Puede reducir el trabajo posterior a la purificación y mejorar la calidad del producto, y gradualmente se está convirtiendo en una nueva dirección de investigación para el cultivo de células animales a gran escala.
Cuatro. Cultura inmovilizada.
Las células animales se combinan con un vehículo insoluble en agua y luego se cultivan. Ambos tipos de células son adecuados y tienen las ventajas de una alta densidad de crecimiento celular, una fuerte resistencia al corte y una gran capacidad anticontaminación. Las células son productos fáciles de separar, lo que favorece la separación y purificación de productos. Existen muchos métodos de preparación, incluido el método de adsorción, el método de unión del estado de valencia, el método de reticulación del estado de ion/valencia, el método de inclusión, el método de microcápsulas, etc.
1. Método de adsorción: El método de fijar las células adsorbiéndolas en su superficie mediante un adsorbente sólido se denomina método de adhesión. La operación es sencilla y las condiciones son suaves. Es el método más antiguo utilizado para inmovilizar células animales. Las desventajas son: la carga del soporte es baja y la batería se cae fácilmente. El cultivo de microportadores y el cultivo de fibras huecas son representantes de este método, que se presentará más adelante.
2. * * *Método de unión de valencia: El método de inmovilización en el que células animales se combinan con portadores sólidos a través de enlaces * * * se llama * * * método de unión de enlace covalente. Este método puede reducir la fuga de células, pero introduce reactivos químicos, lo que afecta la actividad de las células y, debido a que el límite de adhesión y difusión es pequeño, las células no están protegidas.
3. Método de reticulación ion/* * *valente: cuando la suspensión celular se trata con un reactivo bifuncional, se formarán puentes entre las células y la floculación producirá efectos de reticulación. Este método de fijación de células se llama reticulación iónica/valente. Los agentes reticulantes pueden causar muerte celular parcial y también pueden causar limitaciones en la difusión.
4. Método de incrustación: El método de incrustar células en un soporte poroso para producir células inmovilizadas se denomina método de incrustación. Las ventajas son pasos simples, condiciones suaves, carga grande, menos fugas de celda y resistencia al corte mecánico. Las desventajas son: limitaciones de difusión, no todas las células tienen una concentración óptima de matriz, la matriz macromolecular no puede penetrar en la red polimérica. En general es adecuado para la inmovilización de células independientes de la unión. Los vehículos comúnmente utilizados son geles porosos como gel de agarosa, gel de alginato cálcico y fibrina.
5. Microencapsulación: utilice una membrana semipermeable hidrófila para envolver las células en microcápsulas en forma de cuentas para que las células no puedan escapar, pero las moléculas pequeñas y los nutrientes puedan entrar y salir libremente de la membrana semipermeable; Un entorno de cultivo diminuto, similar al cultivo líquido, protege a las células del daño, por lo que las células crecen bien y en alta densidad.
El diámetro de las microcápsulas debe controlarse entre 200 y 400 μm y durante la preparación se debe prestar atención a lo siguiente:
Es suave, rápido, no daña las células y funciona en condiciones líquidas y fisiológicas. condiciones tanto como sea posible;
Los reactivos y materiales de membrana utilizados no son tóxicos para las células;
El tamaño de los poros de la membrana se puede controlar y los nutrientes y metabolitos deben pasar libremente;
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La membrana debe tener suficiente resistencia mecánica para resistir daños durante la agitación.