Este experimento utiliza disolventes orgánicos para purificar polisacáridos. ¿Existen reactivos o métodos alternativos?
Además, los polisacáridos, como tipo de medicamento, tienen muy poca toxicidad, por lo que la investigación sobre los polisacáridos ha despertado un gran interés.
Dado que la actividad biológica de los polisacáridos está estrechamente relacionada con su estructura, y la estructura de los polisacáridos es bastante compleja, la investigación en esta área es relativamente lenta. Sin embargo, se ha trabajado mucho en el aislamiento, extracción y purificación de polisacáridos.
1. Extracción de polisacáridos [12]
1.1 Método de extracción con agua caliente:
1.1.1 Optimización de las condiciones de extracción de polisacáridos
Según los informes bibliográficos [13], los principales factores que influyen en la extracción de polisacáridos con agua caliente son el tiempo de extracción, los tiempos de extracción, el volumen de disolvente, la temperatura de extracción, el valor del pH, la concentración de precipitación de alcohol y el tamaño de las partículas de la planta. Antes del experimento, los factores anteriores se optimizaron mediante experimentos ortogonales y se seleccionó el mejor plan de extracción.
1.1.2 Los pasos son: materias primas → trituración → desengrasado → extracción del crudo (2-3 veces) → filtración o centrifugación → precipitación → lavado → secado.
En primer lugar, retira la grasa superficial. Después de triturar las materias primas, agregue metanol, éter, etanol, acetona o una solución mixta 1:1 de etanol y éter, caliente y agite en un baño de agua o reflujo durante 1 a 3 horas. El residuo obtenido por filtración después de desengrasar se usa generalmente como solvente (también se puede usar una solución acuosa alcalina de hidróxido de potasio, una solución acuosa de cloruro de sodio, 1 ácido acético, 1 fenol. Controlar la temperatura a 90-100 °C, agitar durante 4- 6 horas y extraer repetidamente 2-3. La mayoría de los extractos de polisacáridos son viscosos y se pueden filtrar mediante succión. Las impurezas insolubles también se pueden eliminar mediante centrifugación y el filtrado o sobrenadante debe mezclarse (el polisacárido resultante debe neutralizarse si es alcalino). ), y luego se agrega 2-. Use 5 veces la cantidad de alcohol inferior (metanol o etanol) para precipitar el polisacárido. También puede agregar una solución de reactivo de hierro, sulfato de amonio o bromuro de cetiltrimetilamonio para combinar con el polisacárido para formar un complejo insoluble. sal y luego precipitar con etanol a su vez Lavar con acetona y éter Transferir rápidamente el polisacárido suelto lavado a un secador al vacío lleno de pentóxido de fósforo e hidróxido de sodio para secar al vacío (si el polisacárido precipitado es gelatinoso o viscoso, se puede congelar). directamente seco). Después del secado, se puede obtener polisacárido crudo en polvo.
1.2 Método de extracción asistido por microondas:
El principio es utilizar los diferentes grados de absorción de la energía de las microondas mediante diferentes polaridades. Los medios para lograr selectividad p>
Debido a que las microondas pueden acelerar en gran medida la ruptura de las paredes celulares, pueden acelerar en gran medida la extracción de ingredientes activos de la medicina herbaria china y mejorar el rendimiento de la extracción. Además, debido a la buena selectividad, la matriz puede mantener buenas propiedades después. extracción, y el extracto es mejor que los ordinarios. El método de extracción es más claro [15].
Nie Jinyuan et al. compararon los efectos de la extracción asistida por microondas, la extracción asistida por ultrasonidos y la extracción Soxhlet en la extracción de polisacáridos y flavonoides de Bupleurum [18] y descubrieron que el método de extracción asistida por microondas requería la En el tiempo más corto (10 minutos), la tasa de extracción de polisacáridos fue la más alta (28,46).
1.3 Método asistido por ultrasonidos:
El principio es utilizar cavitación ultrasónica para acelerar la extracción de ingredientes vegetales eficaces y la vibración mecánica, emulsificación, difusión, trituración y efectos químicos de los ultrasonidos. ondas, etc. El efecto de primer orden también puede acelerar la difusión y liberación de los componentes que se extraerán y mezclarse completamente con el disolvente, lo que es beneficioso para la extracción [16].
En comparación con los métodos de extracción convencionales, el método de extracción asistido por ultrasonidos tiene las ventajas de un tiempo de extracción corto, un alto rendimiento y no necesita calentamiento [17].
1.4 Método de extracción Soxhlet:
Coloque el polvo de la planta en un extractor Soxhlet, agregue éter de petróleo y extraiga a 60 ℃ -90 ℃ hasta que esté incoloro (generalmente 6 horas). Filtrar, esperar a que el disolvente se evapore y se seque, agregar etanol al 80%, extraer durante 6 horas, filtrar, evaporar el etanol en el residuo del filtro hasta sequedad y agregar agua destilada. Refluir y extraer dos veces, filtrar en caliente, concentrar el filtrado a presión reducida, eliminar las proteínas, la precipitación de alcohol y eliminar el pigmento. Secar a 60°C; c y pesar.
1.5 Extracción alcohólica:
Añadir uno tras otro etanol 90 y 50 al polvo de la planta, agitar bien la mezcla y luego filtrar. Agregue suficiente etanol absoluto al filtrado y colóquelo en un refrigerador a 4°C durante la noche. Filtrado al vacío para eliminar el pigmento para obtener polisacárido crudo, secarlo en una estufa ventilada a 60°C y almacenarlo en una bandeja de secado a peso constante.
El método de extracción con alcohol es simple y fácil de operar, pero la tasa de extracción es baja y la cantidad de etanol es grande, lo que lo hace no adecuado para la extracción a gran escala.
1.6 Otros métodos:
Los métodos de extracción de polisacáridos incluyen extracción con solución alcalina diluida, extracción con solución ácida diluida, método enzimático, etc. Sin embargo, en condiciones de ácido diluido y álcali diluido, los enlaces glicosídicos de los polisacáridos se rompen fácilmente y parte de los polisacáridos se hidrolizan, lo que reduce la tasa de extracción de los polisacáridos. Por lo tanto, muchos experimentos evitan la extracción con soluciones alcalinas diluidas y la extracción con soluciones ácidas diluidas.
2. Purificación de polisacáridos
2.1 Métodos para eliminar impurezas en polisacáridos Los polisacáridos crudos a menudo se mezclan con impurezas como proteínas, pigmentos y oligosacáridos, que deben eliminarse por separado.
2.1.1 Excepto las proteínas
Los polisacáridos obtenidos por precipitación con alcohol u otra precipitación con disolventes suelen mezclarse con más proteínas. Hay muchas formas de eliminar las proteínas: como elegir fenol, cloroformo, tanino y otros reactivos que pueden precipitar proteínas pero no polisacáridos. Sin embargo, el reactivo ácido debe ser corto y la temperatura debe ser baja para evitar la degradación de los polisacáridos. Los métodos comúnmente utilizados son [19]:
2.1.1.1 Método de producto inteligente (método Sevag) [20]: Según las características de la proteína que se desnaturaliza en disolventes orgánicos como el cloroformo y es insoluble en agua, el polisacárido acuoso solución, cloroformo, la proporción de pentanol (o n-butanol) se ajusta a 25:5:1 o 25:4:650. Este método es suave y tiene un buen efecto para evitar la degradación, pero no es muy eficiente. Por ejemplo, el experimento de extracción del polisacárido de Schisandra chinensis tuvo que repetirse más de 30 veces. Y cada vez que se elimina la proteína coloide desnaturalizada, inevitablemente se disolverá una pequeña cantidad de polisacárido. Durante el proceso de tratamiento, precipitará una pequeña cantidad de proteoglicanos y glicoproteínas unidas al polisacárido y la proteína, provocando la pérdida de polisacáridos. Si se pueden agregar algunas enzimas proteolíticas, el método Sevage es mejor.
2.1.1.2 Método de trifluorotricloroetano [21]: Mezcle la solución de polisacárido y trifluorotricloroetano en volúmenes iguales, agite a baja temperatura durante aproximadamente 10 minutos, centrifugue para tomar la capa superior de agua y la capa de agua quedará como se describe arriba. El método se utilizó varias veces para obtener una solución de polisacárido libre de proteínas. Este método es muy eficaz, pero el disolvente tiene un punto de ebullición bajo y es fácilmente volátil, lo que lo hace inadecuado para aplicaciones a gran escala.
2.1.1.3 Método del ácido tricloroacético: agregue 5-30 % de ácido tricloroacético gota a gota a la solución acuosa de polisacárido hasta que la solución ya no esté turbia, déjela a 5-10 °C durante la noche y centrifugue para eliminar el precipitar para obtener una solución de polisacárido proteolítico. Este método puede provocar la degradación de algunos polisacáridos.
El método Sevag, el método del trifluorotricloroetano y el método del ácido tricloroacético no son adecuados para los glicopéptidos porque los glicopéptidos precipitarán como proteínas. Para las glicoproteínas estables a los álcalis, esta proteína de unión se puede aislar mediante un tratamiento suave con álcali diluido en presencia de borohidruro de potasio [1].
2.1.1.4 Hidrólisis enzimática [22]: Enzimas proteolíticas, como pepsina, tripsina, papaína, pronasa, etc. Se agrega a la solución de muestra para degradar las proteínas de la muestra. Generalmente, el efecto de eliminación de proteínas es mejor cuando se combina con el método Sevag.
2.1.1.5 Método del ácido clorhídrico [23]: Tomar la muestra concentrada, ajustar su pH a 3 con 2mol/L de ácido clorhídrico, dejar reposar durante la noche, centrifugar a 3000r/min, descartar el precipitado, que es decir, eliminar la proteína.
Además, Li Zhimin [23] y Ye Jiangyu [25] demostraron que las tasas de eliminación de proteínas del método del ácido clorhídrico, el método del ácido tricloroacético y el método Sevag fueron 72,5, 46,1 y 42,3 respectivamente, y el polisacárido la tasa de pérdida fue 15,1 y 6,65438. El método del ácido clorhídrico tiene una alta tasa de desproteinización, pero la tasa de pérdida de polisacáridos también es alta. El método del ácido tricloroacético es suave, pero la eficiencia de eliminación de proteínas no es alta; el efecto de desproteinización del método Sevag no es tan bueno como el de los dos primeros.
2.1.1.6 Otros métodos: Añadir solución de 5ZnSO4 y solución saturada de Ba(OH)2, agitar bien y centrifugar para eliminar la proteína. Este método no es lo suficientemente completo para eliminar proteínas y puede usarse junto con el método Sevag. Alternativamente, se puede agregar solución de TCA al 50% a la solución de extracción hasta que se complete la precipitación, y el sobrenadante se puede recolectar centrifugando a 4000 rpm durante 65,438 ± 00 minutos, que es una solución libre de proteínas. Otros usan una solución de cloroformo y etanol 4:1 para eliminar las proteínas, agitan la mezcla, luego la dejan reposar y toman el sobrenadante. Este proceso debe repetirse muchas veces para eliminar la proteína.
Compruebe la muestra eliminada de proteínas con un espectrofotómetro UV y observe si hay absorción a 280 mm. Si no hay absorción, indica que la proteína se ha eliminado [24].
2.1.2 Despigmentación
2.1.2.1 Carbón activado despigmentante [12]: El carbón activado es un adsorbente apolar con fuerte capacidad de adsorción, especialmente indicado para sustancias de separación solubles en agua. . Es abundante en fuentes, de precio económico, tiene una gran capacidad de carga de columnas y es adecuado para la preparación y separación a gran escala. Actualmente, el carbón activado utilizado para la separación cromatográfica se divide principalmente en tres tipos: carbón activado en polvo, carbón activado granular y carbón activado de nailon. En general, trate de evitar el uso de carbón activado para el tratamiento, porque el carbón activado absorberá los polisacáridos y provocará la pérdida de polisacáridos.
2.1.2.2 Los polisacáridos de origen vegetal pueden contener compuestos fenólicos y son de color más oscuro. La mayoría de estos pigmentos son iones negativos y los adsorbentes de carbón activado no pueden decolorarlos. Para adsorber pigmentos se pueden utilizar resinas débilmente alcalinas DEAE celulosa o Duolitea-7.
2.1.2.3 Si el azúcar se combina con pigmento, la celulosa DEAE lo absorbe fácilmente y no puede eluir con agua. Este pigmento se puede oxidar y decolorar: ajuste el valor del pH a aproximadamente PH8,0 con amoníaco concentrado o solución de NaOH, agregue H2O2 gota a gota hasta que se vuelva amarillo claro por debajo de 50 °C y manténgalo caliente durante 2 horas.
2.1.2.4 Lavar el polisacárido con acetona, éter anhidro y etanol anhidro en secuencia para obtener un polisacárido relativamente puro. Este método es simple y fácil de operar y la pérdida de polisacárido también es pequeña.
2.1.2.5 Utilice cloroformo-n-butanol 4:1 para eliminar el pigmento. El funcionamiento es sencillo y se produce cierta pérdida de polisacáridos.
2.1.2.6 Generalmente, los polisacáridos obtenidos por fermentación son de color más claro y contienen menos pigmento, y generalmente no necesitan eliminar pigmentos.
2.1.2.7 Los polisacáridos extraídos de animales y microorganismos también se pueden procesar según los métodos anteriores según diferentes situaciones.
2.1.3 Eliminar impurezas de moléculas pequeñas como oligosacáridos.
2.1.3.1 Utilizar diálisis de flujo inverso. Es decir, preparar un balde de agua destilada, usar un tubo para introducir el agua en el fondo del vaso de la bolsa de diálisis, usar otro tubo para guiar el agua hacia afuera, controlar el caudal según la cantidad de agua, y dejar correr el agua lentamente durante 48 horas. De este modo se obtiene el producto semiacabado de polisacárido.
2.1.3.2 Utilice el efecto de difusión de la concentración de la solución para penetrar sustancias de pequeño peso molecular, como sales inorgánicas y oligosacáridos, en el agua destilada fuera de la bolsa de diálisis y mantenga la diferencia de concentración cambiando continuamente el agua, de modo que Eliminación de pequeñas impurezas moleculares.
El método específico es cortar la bolsa de diálisis de la longitud correspondiente según el volumen de la solución de polisacárido, sujetar un extremo con una pinza para diálisis, inyectar la solución de polisacárido, sujetar la bolsa de diálisis a 2-3 cm de distancia de la superficie del líquido y colocarla. en un vaso de precipitados grande y vierta agua destilada hasta sumergir completamente la bolsa de diálisis, revuelva lentamente con un agitador magnético, cambie el agua cada 12 horas, repita 3-4 veces.
2.2 Métodos de purificación de polisacáridos La purificación es el proceso de separar una mezcla de polisacáridos en polisacáridos individuales. Los métodos de purificación incluyen principalmente los siguientes:
2.2.1 Método de precipitación gradual De acuerdo con las diferentes propiedades de solubilidad de varios polisacáridos en diferentes concentraciones de alcohol inferior o acetona, se agregan metanol y etanol en orden de proporciones pequeñas a grandes. O acetona, recoger los precipitados en diferentes concentraciones. Después de repetidas disoluciones y precipitaciones, la constante física medida es una constante (la más utilizada es la medición de rotación específica o la inspección por electroforesis). Este método es adecuado para la separación de polisacáridos con diferente solubilidad. Para estabilizar los polisacáridos, esto generalmente se hace a pH 7. Sólo los polisacáridos ácidos existen en forma de iones -COOH' a pH 7, por lo que es necesario separarlos a pH 2-4. Para evitar la hidrólisis de los enlaces glicosídicos, se debe trabajar rápidamente. Además, los polisacáridos también se pueden convertir en diversos derivados, como éter metílico, acetilación, etc. Luego se disuelve el derivado de polisacárido en alcohol y, finalmente, se añade un disolvente menos polar, como éter dietílico, para la precipitación fraccionada y la separación.
2.2.2 Método de salinización: Añadir sales inorgánicas al extracto acuoso de productos naturales hasta alcanzar una determinada concentración o saturación, reduciendo así la solubilidad de los principios activos en agua y haciéndolos solubles en otras aguas. Las impurezas altamente resistentes se precipitan y separan. Las sales inorgánicas que a menudo se salan incluyen cloruro de sodio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio y sulfato de amonio.
2.2.3 Precipitación de sales de amonio cuaternario La sal de amonio cuaternario y su hidróxido son emulsionantes que pueden formar precipitados insolubles con azúcares ácidos y se utilizan a menudo para la separación de polisacáridos ácidos. Generalmente, las sales de amonio cuaternario y sus hidróxidos no precipitan con polisacáridos neutros, pero cuando aumenta el valor del pH de la solución o se agrega tampón de bórax para aumentar la acidez del azúcar, también precipitarán con polisacáridos neutros. Las sales de amonio cuaternario comúnmente utilizadas incluyen el bromuro de cetiltrimetilamina (CTAB) y su hidróxido (CTA-OH) y el clorhidrato de cetilpiridina (CP-OH). En términos generales, en soluciones de polisacáridos con concentraciones de CTAB o CP-OH de 1-10 (p/v), los polisacáridos ácidos pueden precipitar a partir de polisacáridos neutros, por lo que se pueden separar diferentes ácidos controlando la concentración de polisacáridos de sales de amonio cuaternario. Vale la pena señalar que el valor de pH de la solución de la mezcla ácida de polisacáridos debe ser inferior a 9 y no debe haber bórax, de lo contrario precipitarán polisacáridos neutros.
2.2.4 Cromatografía en columna: incluida la cromatografía en columna de celulosa, la cromatografía en columna de intercambio aniónico de celulosa, la cromatografía en columna de gel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía líquida de alta presión y otras cromatografías en columna. Por ejemplo, se utilizan carbón activado y gel de sílice como vehículos para separar polisacáridos o se utiliza resina de intercambio iónico de tipo bórax para separar polisacáridos neutros.
La cromatografía en columna de celulosa separa los polisacáridos mediante cromatografía en columna de celulosa y tiene las propiedades tanto de la cromatografía de adsorción como de la cromatografía de distribución. Los eluyentes utilizados fueron agua y soluciones acuosas de etanol de concentraciones variables. El orden de elución de la columna suele ser que la columna con alta solubilidad en agua sale primero y la columna con poca solubilidad en agua sale al final, lo que es exactamente lo opuesto al método de precipitación fraccionada.
DEAE - celulosa (ácido bórico o tipo alcalino) es el agente de intercambio más común en la cromatografía en columna de intercambio aniónico de celulosa. El eluyente puede ser soluciones alcalinas, soluciones de bórax, soluciones salinas, etc. de diferentes concentraciones. Este método es actualmente el más utilizado. Por un lado, puede purificar polisacáridos y, por otro lado, también es adecuado para separar diversos polisacáridos ácidos, polisacáridos neutros y mucopolisacáridos.
Cromatografía en columna de gel La cromatografía en columna de gel puede separar polisacáridos en función de diferencias en el tamaño y la forma molecular. Los geles de uso común incluyen sefadex G, biogel de sefarosa A, gel de poliacrilamida P, etc. Los eluyentes de uso común incluyen soluciones salinas y tampones de diversas concentraciones, pero su fuerza iónica es mejor que 0,02. El orden de salida de la columna es que las moléculas grandes salen primero de la columna y las moléculas pequeñas salen de la columna después. Debido a la interacción de las moléculas de azúcar con el gel, el volumen del eluato difiere mucho del volumen de la proteína. En la separación de polisacáridos, las sales inorgánicas y los compuestos moleculares pequeños de los polisacáridos generalmente se eliminan con geles de poros pequeños como Sephadex G-25 y G-50, y luego se separan con geles de poros grandes como Sephadex G-200.
La cromatografía en columna de gel no es adecuada para la separación de mucopolisacáridos.
La cromatografía de afinidad utiliza lectinas (generalmente proteínas y glicoproteínas) como cromatografía de afinidad para separar polisacáridos.
Cromatografía líquida de alta presión
2.2.5 Los polisacáridos con diferentes tamaños moleculares, formas y cargas negativas tienen diferentes movilidades en el área de preparación bajo la acción de un campo eléctrico, por lo que diferentes Los polisacáridos pueden pasar por separación electroforética; el portador comúnmente utilizado para la electroforesis es el polvo de vidrio. La operación específica es mezclar el polvo de vidrio con agua para formar un gel y una columna, equilibrarlo con un tampón de electroforesis (como una solución acuosa de bórax de 0,05 mol/L, PH9,3) durante 3 días, agregar polisacárido al extremo superior del Columna, encienda la alimentación y el extremo superior es el electrodo positivo (polisacárido. La dirección de la electroforesis es hacia el electrodo negativo), el extremo inferior es el electrodo negativo, el voltaje por centímetro es 1,2-2 V y el. La corriente es de 30-35 mA. Después de la electroforesis, el soporte de polvo de vidrio se extrae de la columna, se eluye por separado y se detecta después de la segmentación. Este método tiene un buen efecto de separación, pero sólo es adecuado para uso a pequeña escala en laboratorios. Debe haber un sándwich de enfriamiento en la columna de electroforesis.
2.2.6 Los agentes complejantes comúnmente utilizados en el método del complejo metálico incluyen la solución de Feining, cloruro de cobre, hidróxido de bario y acetato de plomo.
2.2.7 Otros métodos: Además de los métodos anteriores, también existen la ultrafiltración (las soluciones de polisacáridos se pueden separar mediante varias membranas de ultrafiltración conocidas) y la cromatografía en columna de carbón activado. También se informa que el sistema de cromatografía en columna LKB ampliamente utilizado en el extranjero utiliza rotación específica, refracción diferencial y UV para detectar polisacáridos y registrar automáticamente las posiciones de los picos de cada componente. El efecto de separación es bueno y conveniente.
2.3 Identificación de la pureza del polisacárido
2.3.1 Ultracentrifugación Dado que la velocidad de movimiento de las partículas en el campo centrífugo está relacionada con la densidad, el tamaño y la forma de las partículas, cuando la solución de polisacárido se somete a ultracentrifugación en gradiente de densidad. Durante la centrifugación, si el polisacárido es homogéneo en composición, debe presentar un solo pico. Específicamente, la muestra de polisacárido se prepara en una solución de 1-5 usando 0,1 moles de NaCl o 0,1 moles de tampón de sal Tris y luego se realiza una ultracentrifugación de densidad. Después de que la velocidad de rotación alcanza una constante (generalmente 60000 r/min), se detecta si se trata de un pico único mediante iluminación a intervalos.
2.3.2 Método de electroforesis de alto voltaje Los polisacáridos neutros a menudo se convierten en complejos de ácido bórico para la electroforesis de alto voltaje debido a su mala conductividad, su gran peso molecular y su lento movimiento en el campo eléctrico. La composición y el peso molecular de los polisacáridos son diferentes, por lo que los complejos formados por los polisacáridos y el ácido bórico son diferentes y su movilidad relativa bajo la acción del campo eléctrico también es diferente. Por lo tanto, la pureza de los polisacáridos puede determinarse mediante electroforesis de alto voltaje. . Habitualmente los soportes utilizados en la electroforesis de alto voltaje incluyen papel de fibra de vidrio, tela de seda, gel de poliacrilamida, membrana de acetato de celulosa, etc. La solución tampón es una solución de bórax de 0,03 a 0,1 moles, el pH es de 9,3 a 12, la intensidad del voltaje es de aproximadamente 30 a 50 V/cm y el tiempo es de 30 a 120 minutos. Debido a que la electroforesis genera mucho calor, se requiere un sistema de enfriamiento para mantener la temperatura alrededor de 0°C; de lo contrario, el stent se quemará. Generalmente, los monosacáridos y oligosacáridos no son evidentes en los polisacáridos debido a la reacción de color de los grupos aldehído. Después de la electroforesis, los reactivos cromogénicos comúnmente utilizados son el reactivo de p-anisidina y periodato de Schiff.
2.3.3 Los geles comúnmente utilizados para la cromatografía en columna de gel incluyen Sephadex, Sepharose y Sephacryl. El agente revelador es una solución de NaCl de 0,02-0,02-0,2 moles o 0,04 moles de piridina y 0,02 moles de ácido acético 1:1, y la relación entre la altura de la columna y el diámetro de la columna es superior a 40.
2.3.4 Método de rotación óptica: Agregar etanol a la solución acuosa de polisacárido hasta una concentración de aproximadamente 65438±00 y centrifugar para precipitar. Agregue etanol al sobrenadante a una concentración de 20-25, centrifugue para obtener un precipitado secundario y compare la rotación óptica específica del precipitado secundario. Si la rotación específica es la misma, es pura, en caso contrario es una mezcla.
2.3.5 Otros métodos: La relación molar de grupos funcionales debe ser constante, es decir, la relación molar de -COOH, -NH2, -SO3H, -CHO y otros grupos funcionales del producto obtenido por separar el producto puro dos veces debe ser constante. Métodos similares incluyen el método del índice de refracción y el método HPLC. Además, en Alemania se utiliza a menudo la cromatografía líquida de alta presión para detectar la pureza de los polisacáridos y los resultados son fiables.
Debe tenerse en cuenta que la inspección de pureza generalmente requiere que se determinen los resultados de los dos métodos anteriores.