Cómo detectar la presencia del complemento
Sección 1: Naturaleza y vías de activación del complemento
1. Naturaleza del complemento
Complemento (C): es un grupo de enzimas. actividades similares, Glicoproteína termolábil y persistentemente reactiva en suero y fluidos tisulares de humanos y vertebrados. Es una condición complementaria necesaria para que los anticuerpos ejerzan su efecto citolítico, por eso se denomina complemento.
Función del sistema del complemento:
Ampliamente implicado en la respuesta de defensa antiinfecciones del organismo,
Mediando la lisis celular,
Acondicionamiento y deglución,
Adhesión inmune,
Participación en el daño inmunológico causado por reacciones inflamatorias, etc.
El complemento se divide en tres categorías según sus propiedades y funciones. , a saber
① Hay 9 componentes intrínsecos del sistema del complemento, denominados C1-C9 ② La mayoría de los componentes que regulan la activación del sistema del complemento reciben el nombre de sus funciones, como los inhibidores de C1.
③El receptor del complemento (CR) lleva el nombre de su compañero de unión.
2. Vía de activación del complemento
Método clásico
Método alternativo
Vía MBL
(1) La forma clásica de activación del complemento
es la vía de activación en la que los anticuerpos IgG (1, 2, 3) o IgM sirven como activador principal y se unen al antígeno. El proceso de activación comienza desde C1q, y todo. Componentes del complemento C1~C9* *11 Ingredientes implicados.
2) Vías alternativas de activación del complemento
La vía alternativa de activación del complemento también se denomina vía alternativa. Lo que se diferencia de la vía clásica es la activación del complejo con el antígeno. .
Esto es irrelevante y no específico. Sin la participación de c1, c4 y c2, c3 se activa directamente para completar el proceso de activación de c5 ~ c9.
Determinación de la actividad del complemento total en suero (prueba CH50)
Principios experimentales
La actividad más importante del complemento es la lisis celular, que puede detectarse fácilmente mediante hemólisis . En un sistema de reacción adecuado y estable, la dependencia de la dosis de la hemólisis con respecto al complemento presenta una curva especial en forma de S. En la hemólisis leve y cerca de la hemólisis completa, los cambios en la cantidad de complemento no pueden cambiar significativamente el grado de hemólisis, es decir, la hemólisis no es sensible a los cambios en la cantidad de complemento. Sin embargo, la curva es más pronunciada en la semihemólisis (50% de hemólisis). El grado de hemólisis puede variar mucho incluso con pequeños cambios en el contenido del complemento, lo que significa que es muy sensible a los cambios en las cantidades del complemento. Por lo tanto, utilizar un 50% de hemólisis como criterio de valoración es mucho más sensible que un 100% de hemólisis. Este método se llama hemólisis del complemento al 50%, o CH50 para abreviar.
2) Método de prueba
1. Glóbulos rojos de oveja: la concentración es generalmente del 2% al 5%.
2. Hemolisina: anticuerpo anti-glóbulos rojos de oveja. Debe calentarse a 56 ℃ o 60 ℃ durante 30 minutos antes de la prueba para inactivar el complemento.
3. Tampón de dilución: tampón fosfato o tampón barbitúrico.
4. Tubo estándar de hemólisis al 50%:
5. Tome muestras de suero frescas para realizar pruebas. Agregue reactivos y reactivos a cada tubo de ensayo según sea necesario y colóquelos en un baño de agua a 37°C durante 30 minutos.
Después de la incubación, centrifugar todos los tubos a 2500 rpm durante 5 minutos. Mediante observación y comparación, seleccione dos tubos con un grado de hemólisis similar al tubo estándar y lea la absorbancia en un espectrofotómetro respectivamente. Tome el tubo más cercano al tubo estándar como el tubo de reacción más eficaz, tome su factor de dilución y sustitúyalo. en la siguiente fórmula para obtener CH50 El valor medido (unidad U).
Actividad total del complemento por mililitro de suero (unidad) = 1/dosis de suero × factor de dilución
3) Evaluación del método
La prueba CH50 mide la actividad total del complemento en de forma clásica La actividad hemolítica del complemento refleja el nivel integral de los nueve componentes del complemento. Este método es sencillo y rápido, pero tiene baja sensibilidad. La actividad hemolítica del complemento es inversamente proporcional al volumen de reacción en la prueba y también está relacionada con el pH, la fuerza iónica, la concentración de calcio y magnesio, el número de SRBC y la temperatura de reacción.
Los iones de calcio y magnesio tienen un efecto estabilizador sobre el sistema hemolítico, pero el exceso de iones de calcio y magnesio tienen un efecto inhibidor sobre la reacción hemolítica.
Determinación de los componentes únicos del complemento
Primero, método de hemólisis inmune
Segundo método inmunoquímico
Prueba de fijación del complemento
La prueba de fijación del complemento (CFT) es una prueba que utiliza el mecanismo hemolítico inmunológico como sistema indicador para detectar antígenos o anticuerpos de otro sistema de reacción. Wasserman lo aplicó al diagnóstico de la sífilis ya en 1906, lo que también se conoce como reacción de Fahrenheit.
Este experimento tradicional se ha mejorado continuamente y no sólo se utiliza para el diagnóstico y la investigación epidemiológica de enfermedades infecciosas, sino también para la detección y análisis de algunos autoanticuerpos, antígenos relacionados con tumores y HLA.
1. Principios de prueba
Este experimento tiene cinco componentes que participan en la reacción, que pertenecen a tres sistemas: ① sistema de reacción, es decir, el antígeno (o anticuerpo) conocido y el anticuerpo a analizar (o antígeno);
②Sistema de complemento;
③El sistema indicador, es decir, SRBC y la hemolisina correspondiente, a menudo se combinan de antemano para formar glóbulos rojos sensibilizados. El sistema de respuesta compite con el sistema de indicadores por el sistema del complemento, y el sistema de respuesta se agrega primero, dándole la oportunidad de unirse preferentemente al complemento.
2. Métodos de prueba
Existen muchos métodos para mejorar la prueba de fijación del complemento. Los métodos más utilizados incluyen el método de volumen total (3 ml), el método de medio volumen (1,5 ml) y el método de pequeñas cantidades. (0,6 ml), Micrométodo (método de placa de plástico). Actualmente, ambos métodos tienen amplias perspectivas de aplicación porque pueden ahorrar antígenos, utilizar menos muestras de suero y tener una mejor especificidad. La siguiente descripción toma como ejemplo el método de volumen pequeño, es decir, agregar 0,1 ml de cada uno de antígeno, anticuerpo, hemolisina y glóbulos rojos de oveja, y agregar 0,2 ml de complemento, para un total de 0,6 ml.
(1) Reactivos
1. Antígeno: El antígeno utilizado para detectar anticuerpos en la prueba debe estar adecuadamente purificado. Cuanto mayor sea la pureza, más fuerte será la especificidad. Si se utiliza antígeno crudo, se debe comparar con tejido normal tratado de la misma manera para identificar respuestas no específicas a los componentes del tejido normal que pueden estar presentes en el suero que se va a analizar. 2. Titulación de antígeno y anticuerpo: en la prueba de fijación del complemento, el antígeno y el anticuerpo se combinan en una proporción determinada, por lo que se debe seleccionar la proporción de concentración adecuada a través de la prueba. La titulación a menudo utiliza el método de matriz cuadrada, y se selecciona la dilución más alta (100% sin hemólisis) tanto del antígeno como del anticuerpo con una fuerte reacción positiva como título (unidad) del antígeno y el anticuerpo.
3. Titulación del complemento: Generalmente se utiliza complemento de cobaya y los reactivos se van añadiendo progresivamente a la titulación del complemento 9. Se determinó que la cantidad más pequeña de complemento que se observó que producía hemólisis completa después de la incubación era 1 unidad práctica, y en ensayos formales se utilizaron dos unidades prácticas.
(2) Muestra de suero
Después de recolectar la muestra de sangre, separe el suero a tiempo y revíselo a tiempo o guárdelo a -20 ℃. Antes de la prueba, el suero debe calentarse entre 56°C y 60°C durante 3 minutos (o 60°C durante 3 minutos) para destruir el complemento y eliminar ciertos factores no específicos.
Cuando las muestras de suero encuentran fenómenos antiestrés, se puede realizar uno de los siguientes tratamientos: ① Calentamiento a 65438±02°C
(2) Congelación y descongelación a -20; °C Precipitación centrífuga;
③3 mmol/L tratamiento con ácido clorhídrico
(4) Agregue una pequeña cantidad de complemento y luego caliente para inactivar; ⑤ Tratar con arcilla blanca
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⑥ Inyectar CO2
⑦ Tratar con polvo de hígado de ratón
⑧ Diluir el complemento con solución salina fisiológica; 10% clara de huevo fresca.
(3) Prueba formal
Tomemos como ejemplo la prueba de fijación del complemento de anticuerpos con micrométodo. Agregue gradualmente varios reactivos y observe varios tubos de control de calidad después de la incubación. Los resultados deben ser consistentes con los resultados esperados.
3. Evaluación del método
La prueba de fijación del complemento es una tecnología inmunológica tradicional y todavía se puede utilizar en la actualidad, lo que demuestra que tiene ciertas ventajas: ① Alta sensibilidad. El proceso de activación del complemento es amplificador y mucho más sensible que las reacciones de precipitación y aglutinación. Los anticuerpos se pueden medir a 0,05 μg/ml, lo que es comparable a la sensibilidad de la aglutinación indirecta. ② Fuerte especificidad. Se titulan varios componentes de la reacción de antemano y se selecciona la proporción óptima, por lo que la posibilidad de reacción cruzada es muy pequeña, especialmente cuando se utilizan métodos de traza o traza. ③Amplia gama de aplicaciones y se puede utilizar para detectar varios tipos de antígenos o anticuerpos. ④ Fácil de promover, el efecto de la prueba es obvio; las condiciones de la prueba son bajas y no se necesitan instrumentos especiales ni colorímetro fotoeléctrico.