Método de detección de la curva de crecimiento microbiano

Método de medición del volumen: también conocido como método de medición de la concentración de micelio.

Midiendo el número de hifas contenidas en un determinado volumen de medio de cultivo se puede reflejar el estado de crecimiento de los microorganismos. El método consiste en tomar una determinada cantidad del medio de cultivo a analizar (por ejemplo, 10 ml) y colocarlo en un tubo de centrífuga graduado, establecer un tiempo de centrifugación determinado (por ejemplo, 5 minutos) y una velocidad de rotación (por ejemplo, 5000 rpm). y se vierte el sobrenadante después de la centrifugación, se midió que el volumen de sobrenadante era V y la concentración de micelio era (10-V)/65438. La determinación de la concentración de micelio es un importante indicador de seguimiento del crecimiento microbiano en la producción de fermentación industrial a gran escala. Este método es generalizado, simple y rápido, pero necesita establecer condiciones de procesamiento consistentes; de lo contrario, la desviación será grande, porque hay algunos nutrientes sólidos mezclados en el sedimento centrífugo, y los resultados estarán algo sesgados.

Método de pesaje peso seco:

Se puede determinar mediante centrifugación o filtración. Generalmente el peso seco es del 10-20% del peso húmedo. El método de centrifugación consiste en verter un cierto volumen del medio de cultivo que se va a analizar en un tubo de centrífuga, establecer un tiempo y velocidad de centrifugación determinados, centrifugar, lavar con agua limpia de 1 a 5 veces y secar. El secado puede realizarse en estufa a 105°C o 100°C, o por rayos infrarrojos, o por secado al vacío a 80°C o 40°C, y luego pesarse. Si se utiliza el método de filtración, los hongos filamentosos se pueden filtrar con papel de filtro y las bacterias se pueden filtrar con una membrana de filtro como una membrana de acetato de celulosa. Después de la filtración, enjuagar con una pequeña cantidad de agua y secar al vacío a 40 °C. El método de propagación en seco es más complicado. Por lo general, este método se suele utilizar cuando los productos microbianos obtenidos son células bacterianas, como la levadura seca activa (ADY), algunos piensos y fertilizantes que utilizan células microbianas como sustancias activas.

Turbidimetría:

El crecimiento de microorganismos produce un aumento de la turbidez del cultivo. Utilice un espectrofotómetro UV para medir el valor de absorción de luz de una determinada longitud de onda para determinar el crecimiento de microorganismos. Se puede utilizar un matraz Erlenmeyer especial con brazos laterales para seguir periódicamente el crecimiento de bacterias en un cultivo. Inserte el brazo lateral en el orificio del asiento colorimétrico del colorímetro fotoeléctrico y podrá medir su crecimiento en cualquier momento sin sacar el líquido bacteriano. Este método se utiliza principalmente para controlar el crecimiento de bacterias en la industria de la fermentación. Por ejemplo, utilizo el espectrofotómetro UV-visible de UNICO y uso un tubo colorimétrico para medir periódicamente el valor de absorbancia OD600 del caldo de fermentación a una longitud de onda de 600 nm para controlar el crecimiento y el tiempo de inducción de E. coli.

Medición de la longitud del micelio:

Para hongos filamentosos y algunos actinomicetos, podemos medir la longitud del crecimiento del micelio en el medio de cultivo dentro de un período de tiempo determinado, o utilizar un extremo del Coloque un tubo de vidrio fino graduado y abierto en un medio adecuado, acuéstese e inocule el extremo abierto con microorganismos. Después de un período de tiempo, registre la duración del crecimiento micelial para medir el crecimiento de microorganismos filamentosos.

Método de recuento microbiano

Método de placa de hemocitómetro:

La placa de hemocitómetro es una placa de vidrio gruesa con dimensiones estructurales y espesores especiales. El tobogán tiene cuatro ranuras y dos crestas, con una ranura horizontal corta y dos plataformas en el centro. Las superficies de las dos crestas son 0,1 mm más altas que las superficies de las dos plataformas. Cada plataforma está grabada con rejillas de diferentes especificaciones y 400 pequeños cuadrados están grabados en el área central de 0,1 mm. Observe con una lente de aceite y cuente la cantidad de microorganismos en una determinada célula grande, y podrá calcular la cantidad de bacterias contenidas en 1 ml de líquido bacteriano. Este método es sencillo, intuitivo y rápido, pero sólo es adecuado para contar esporas producidas por microorganismos unicelulares o microorganismos filamentosos. El resultado es el número total de bacterias, incluidas las células muertas.

Métodos de tinción y recuento:

Para compensar el hecho de que algunos microorganismos son difíciles de observar y contar bajo un microscopio de aceite, y el método de la placa del hemocitómetro no puede distinguir directamente entre Células muertas y células vivas, la gente inventó el método de conteo. Las bacterias viables se pueden contar más fácilmente al microscopio con la ayuda de diferentes colorantes. Por ejemplo, se puede utilizar una solución de tinción con azul de metileno para contar el número de células de levadura viables. Después de la tinción, las células vivas son incoloras y las células muertas son azules.

Método de conteo proporcional:

Mezcle el líquido con una concentración de partículas conocida (como esporas de moho o glóbulos rojos) y el líquido bacteriano con la concentración de células que se va a medir uniformemente en un determinado proporción y colóquelos dentro del campo de visión del microscopio. La concentración de células de la solución bacteriana desconocida se puede obtener contando sus números respectivos. Este método de conteo está relativamente extendido. Y es necesario preparar una suspensión con una concentración de partículas conocida como estándar.

Método de dilución líquida:

Las muestras de bacterias desconocidas se diluyen en serie 10 veces. Según la estimación, tomar muestras de 5 ml de las tres diluciones consecutivas 10 veces más apropiadas e inocularlas en tres juegos de tubos de ensayo que contengan medio de cultivo ***15.

Después del cultivo, registre el número de tubos de ensayo cultivados en cada dilución y luego encuentre la tabla de probabilidad máxima MPN (número más probable). Este método se usa comúnmente para detectar microorganismos en los alimentos, como el agua potable y la leche, para realizar pruebas de límite microbiano.

Método de recuento de colonias en placa:

Este es uno de los métodos más utilizados para contar bacterias viables. Lleve a cabo una dilución en gradiente del líquido bacteriano que se va a analizar, tome un cierto volumen del líquido bacteriano diluido y mézclelo uniformemente con un medio de cultivo sólido adecuado antes de la solidificación, o extienda el líquido bacteriano en la placa de medio de cultivo sólido después de la solidificación. Después de la incubación, el recuento bacteriano de la solución bacteriana original se puede calcular multiplicando el número de colonias presentes en la placa por la dilución de la solución bacteriana. Generalmente aparecen entre 50 y 500 colonias en una placa de 9 cm de diámetro. Sin embargo, el método es más problemático y requiere operadores expertos. El método de recuento de colonias en placa no solo puede obtener la cantidad de bacterias viables en el líquido bacteriano, sino también aislar y cultivar las bacterias en el líquido bacteriano al mismo tiempo para obtener clones individuales.

Método del papel de prueba:

Basado en el método de conteo en placas, se desarrolló un pequeño producto comercial para el conteo rápido. Hay trozos pequeños y gruesos de papel de filtro, trozos de agar, etc. Tome el medio de cultivo apropiado sobre papel de filtro y agar, agregue el indicador de actividad cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC, incoloro) para remojar el líquido bacteriano de prueba y luego cultívelo en una bolsa de embalaje sellada. Después de un cultivo a corto plazo, aparecerán pequeñas colonias de color rosa con cierta densidad en el papel de filtro. Comparando el espectro en la placa de color de papel estándar, se puede estimar el contenido bacteriano de la muestra. El método de recuento de papel de prueba es rápido y preciso y evita el error humano del método de recuento de placas.

Método de filtración por membrana:

Utilice una membrana de filtro especial para filtrar un cierto volumen de muestras que contienen bacterias, teñirlas de naranja y observar la fluorescencia de las células bajo un microscopio UV. . Las células vivas emiten fluorescencia naranja, mientras que las células muertas emiten fluorescencia verde.

Método del índice fisiológico:

El crecimiento de los microorganismos va acompañado de cambios en una serie de indicadores fisiológicos, como el pH, el contenido de nitrógeno, el contenido de azúcares, la producción de gases, etc. caldo de fermentación. Existen muchos indicadores fisiológicos paralelos al crecimiento, que pueden usarse como valores relativos para medir el crecimiento.

Determinación del contenido de nitrógeno:

El contenido de nitrógeno de la mayoría de las bacterias es del 12,5% del peso seco, el de la levadura del 7,5% y el del moho del 6,0%. Según el contenido de nitrógeno × 6,25, se puede determinar el contenido de proteína bruta. Existen muchos métodos para medir el contenido de nitrógeno, como la digestión con ácido sulfúrico, la digestión con ácido perclórico, la digestión con ácido yódico, la digestión con ácido fosfórico y el método Dumas para la determinación de gas N2. El método de Dumas para medir el gas N2 consiste en mezclar la muestra con CuO, calentarla en el flujo de gas CO2 para generar gas nitrógeno, recogerlo en el respirómetro y medir la cantidad de N2 después de absorber el CO2 con KOH.

Determinación del contenido de carbono:

Mezclar una pequeña cantidad de material biológico (0,2-2,0 mg de peso seco) en 1 ml de agua o tampón inorgánico y añadir 2 ml de 2%. Solución de K2Cr2O7 en Calentar a 100°C durante 30 minutos y luego enfriar. Agregue agua para diluir hasta 5 ml, lea el valor de absorbancia a una longitud de onda de 580 nm y calcule la cantidad de crecimiento. Es necesario utilizar reactivos como controles en blanco y muestras estándar como curvas estándar.

Determinación de azúcares reductores:

Los azúcares reductores suelen referirse a monosacáridos u oligosacáridos, que pueden ser utilizados directamente por los microorganismos. La determinación de azúcares reductores puede reflejar indirectamente el crecimiento de microorganismos y se utiliza a menudo para el seguimiento rutinario del crecimiento microbiano en la producción de fermentación industrial a gran escala. El método es: centrifugar el caldo de fermentación, tomar el sobrenadante, agregar reactivo de Fehling, hervir al baño maría durante 3 minutos, sacar y agregar un poco de ácido clorhídrico para acidificar, agregar solución de almidón cuando se acerque al punto final, continuar agregando Na2S2O3 hasta el punto final, consulte la tabla para leer el contenido de azúcar reductor.

Determinación del nitrógeno amino:

El método consiste en centrifugar el caldo de fermentación, tomar el sobrenadante, añadir rojo de metilo y ácido clorhídrico como indicadores y añadir NaOH 0,02 N para ajustar el color. hasta que el color sea perfecto. Si se desvanece, agregue 18% de formaldehído neutro como sustrato, reaccione durante unos minutos, agregue 0,02 N para cambiar de color y calcule el contenido de nitrógeno amino en función de la cantidad de NaOH. Según el contenido de nitrógeno amino en el medio de cultivo, puede reflejar indirectamente el estado de crecimiento de los microorganismos.

Determinación de otras sustancias fisiológicas:

Contenido de P, ADN, ARN, ATP, NAM (ácido acetilmurámico) y otros indicadores, como producción de ácido, producción de gas y producción de CO2 ( glucosa marcada como sustrato), el consumo de oxígeno, la viscosidad y la producción de calor se pueden utilizar para determinar el crecimiento. El crecimiento de microorganismos también puede reflejarse en función de cambios en la concentración del sustrato, la producción final de gas y la actividad microbiana antes y después de la reacción.

Por ejemplo, en la producción de fermentación de BMP-2, siempre juzgo el crecimiento de bacterias monitoreando los cambios en el oxígeno disuelto y el valor del pH.

Método comercial de detección microbiana rápida;

La dirección de desarrollo de la detección microbiana es rápida, precisa, simple y automatizada. En la actualidad, muchas empresas de productos biológicos utilizan principios tradicionales de pruebas microbianas y combinan diferentes métodos de prueba para diseñar varios tipos de instrumentos y equipos de pruebas microbianas, que gradualmente se utilizan ampliamente en pruebas microbianas médicas e investigaciones científicas. Por ejemplo:

1. La combinación de un medio antiinterferencia y una tecnología de detección rápida de cantidades microbianas resuelve problemas que no pueden resolverse con los métodos tradicionales de detección microbiana y sienta una base sólida para el establecimiento de una solución antiinterferente completa. Sistema de detección microbiana. Medio de cultivo microbiano antiinterferencias, nuevos tubos de identificación bioquímica, tarjetas de recuento microbiano, kits de pruebas de calidad ambiental, etc. Proporcionado por el Departamento de Industria Cooperativa de la sucursal de Guangzhou de la Academia de Ciencias de China, puede usarse fácilmente para una variedad de pruebas.

2. El recuento bacteriano total totalmente automático y el sistema de detección rápida de bacterias del BACTOMETER pueden obtener resultados de monitoreo en unas pocas horas, y el color y las propiedades ópticas de la muestra no afectan la lectura. El principio de la misma alta sensibilidad para la detección de levaduras y mohos es colocar la muestra y el medio de cultivo que se van a analizar en el kit de reacción mediante tecnología de impedancia. Hay un par de electrodos de acero inoxidable en la parte inferior para medir los cambios de impedancia causados ​​por microbios. crecimiento. Por ejemplo, cuando los microorganismos crecen, una gran cantidad de nutrientes en el medio de cultivo se pueden convertir en pequeñas moléculas activas a través del metabolismo. Este cambio débil se puede detectar mediante el método de impedancia eléctrica, de modo que la presencia de microorganismos se puede monitorear más rápido que el método tradicional. método de placa y cantidad. Los elementos de medición incluyen el número total de bacterias, levaduras, Escherichia coli, moho, bacterias del ácido láctico, termófilas, bacterias gramnegativas, Staphylococcus aureus, etc.